Aplicação biotecnológica : anticorpo monoclonal anti-desoxinivalenol para monitoramento e avaliação da exposição pelo consumo de trigo (Triticum aestivum L.)

Fusarium spp., fitopatógeno relevante no campo, pode produzir micotoxinas de ocorrência inevitável em produtos de origem vegetal. F. graminearum contamina trigo e pode produzir desoxinivalenol (DON), tricotoceno de caráter citotóxico, emético e inibidor de síntese protéica, responsável por perdas na agricultura e produção animal. Analítica sem uso de solvente tóxico e sem equipamento sofisticado tem sido a meta de biotecnologia no controle de qualidade visando segurança alimentar. O trabalho teve como objetivo padronizar método imunológico para detecção de DON em trigo e derivados e avaliar a Ingestão Diária Estimada (IDE) desta toxina pela população de Londrina-PR. Para isso, AcM foi produzido por hibridoma linhagem DON.3 em meio RPMI + 10 % de soro fetal bovino (SFB), sendo o meio gradativamente substituído por Hybridoma-Serum Free Medium (HSFM), resultando em 2320 mL de sobrenadante de cultivo. Os sobrenadantes referentes aos meios contendo RPMI + 10 % SFB, 75 % e 100 % meio H-SFM (1690 mL) foram precipitados com sulfato de amônio a 40 % de saturação, dialisados contra PBS pH 7,3 seguido por água ultra-pura, obtendo-se 71,3 mg de AcM anti-DON semi-purificado para desenvolvimento de Enzyme linked immunossorbent assay ELISA competitivo indireto (ic-ELISA) e coluna de imunoafinidade (CIA). O ensaio ic-ELISA padronizado consistiu de sensibilização com 2 &#956;g/mL de DON-HG-BSA, anti-DON (1,25 mg/mL) diluído a 1:200 e anticorpo secundário (anti-IgGHRP) na diluição 1:2000, com limite de detecção 177,12 &#956;g/kg. A performance do ic-ELISA desenvolvido foi comparada com Cromatografia Líquida de Alta Eficiência-Arranjo de Fotodiodo (CLAE-PDA) e CLAE-Espectrometria de Massas (CLAEEM). A análise de 34 amostras de trigo dos Estados do Paraná e Rio Grande do Sul (safras 2006, 2007 e 2008) indicou a eficiência de ic-ELISA desenvolvido, com coeficiente de correlação com CLAEPDA de 0,84 para detecção de DON em grão de trigo. DON foi detectado em 24 amostras (70,6 %) por CLAE-PDA (ND a 1531,5 &#956;g/kg) e 17 (50,0 %) por ic-ELISA (ND a 1362,1 &#956;g/kg), sendo a relação ic-ELISA/CLAE-PDA de 0,68. A análise de 44 amostras por CLAE-EM apresentou correlação de 0,93 com ic-ELISA, com DON detectado em 22 amostras (50,0 %) por CLAE-EM (ND a 9906,9 &#956;g/kg) e 31 amostras (71,4 %) por ic-ELISA (ND a 12291,4 &#956;g/kg), relação ic-ELISA/CLAE-EM de 1,64. A recuperação de DON por ic-ELISA em amostras artificialmente contaminadas variou de 26,9 % (gérmen de trigo) a 108,4 % (grãos de trigo). Metodologia de extração e posterior análise por ic- ELISA foi satisfatória para as amostras de grãos de trigo (recuperação 108,43 %, desvio padrão relativo DPR 11,7 a 16,1 %) e farinha de trigo (103,0 %, DPR 19,0 a 36,2 %), não ocorrendo o mesmo para quibe e gérmen de trigo. Em suma, o monitoramento de DON por ic-ELISA em 136 amostras de grãos de trigo, obtidas de campos experimentais e de produtores tritícolas, pertencentes a safras de 2006, 2007 e 2008, revelou a presença da toxina em 67,6 %, média de 2140,19 &#956;g/kg (amostras positivas de 206,3 a 16076,5 &#956;g/kg). Oitenta amostras (58,8 %) apresentaram nível de contaminação de DON inferior ao limite máximo permitido pela Comunidade Européia em cereais para o consumo humano (< 1750 &#956;g/kg). Amostras oriundas do Paraná apresentaram contaminação inferior (845,8 &#956;g/kg) à observada no Rio Grande do Sul (3163,8 &#956;g/kg), sendo que também observou-se diferenças significativas entre as diferentes regiões dos Estados e, entre as três safras analisadas (p< 0,05). Referente a 44 amostras de trigo em diferentes fases de processamento em moinho (grão na recepção, trigo limpo, trigo úmido, farinha, gérmen e farelo de trigo), 16 (36,4 %) apresentaram-se positivas por ic-ELISA (ND a 4262,4 &#956;g/kg). Analisando 22 amostras de trigo para quibe coletadas em diferentes estabelecimentos comercias paranaenses por inspetores da Vigilânica Sanitária, DON foi detectado em 10 amostras (45,4 %, média de 166,1 &#956;g/kg, ic-ELISA). Para avaliar o consumo de derivados de trigo, foi utilizado um Questionário de Freqüência de Consumo de Alimentos (270 indivíduos, baseado em população de 447000 habitantes e erro amostral de 6 %). Macarrão e pão francês foram os derivados mais consumidos, observando-se correlação entre o consumo de derivados de trigo e dados sóciodemográficos e antropométricos. A IDE foi calculada considerando-se nível de DON em 76 amostras de grãos de trigo produzidas no Paraná e fator de processamento. A IDE de DON apreciando o consumo de pão francês e macarrão foi 0,82 &#956;g/kg peso corporal/dia, sendo que 85 indivíduos (32,7 iii%) ultrapassaram a Ingestão Diária Máxima Tolerável Provisória de 1 &#956;g/kg p.c./dia. A confecção de protótipos de CIA, utilizando AcM anti-DON produzido, não foi concluída com êxito, devendo-se prosseguir desde etapa de produção de AcM. A ocorrência de DON em trigo e IDE apontam para necessidade de medidas de controle da produção da toxina a nível de campo, já que os métodos de processamento atualmente utilizados não promovem diminuição e/ou detoxificação de DON. As expectativas futuras prometem a utilização deste AcM como ferramenta para desenvolvimento de imunossensores, contribuindo com avanço metodológico através da automação de controle de qualidade segurança alimentar.Fusarium spp., phytopatogen of field relevance, also manifests importance by mycotoxins production, of inevitable occurrence in products of vegetable origin, widely consumed. F. graminearum contaminate wheat and can produce trichothecenes, with emphasis on deoxynivalenol (DON), citotoxic, emetic and inhibitor of proteic synthesis, responsible by losts in agriculture and livestock. Analytical without toxic solvents and sophisticated equipments are goal of biotechnology in the quality control, aiming food safety. Immunochemical methods presents advantages, like cost-effective, water and buffer use, equipament of simple operation and rapid execution, being essencials for trial of DON in food. The aim of this work is to develop an immunological method based on monoclonal antibody (mAb) for DON detection in wheat and wheat based products, involving samples from field, processing mill and commercial kibbe; as well as to evaluate the Estimated Daily Intake (EDI) of this compound by the population of Londrina PR, Brazil. mAb was produced by hybridoma cell line DON.3 in RPMI + 10 % fetal bovine serum (FBS), that was gradativelly replaced by Hybridoma-Serum Free Medium (H-SFM), resulting in 2320 mL of cultive supernatant. The cell culture in synthetic medium containing RPMI + 10 % FBS, 75 % and 100 % H-SFM (1690 mL) was precipitaded with ammonium sulfate (40 % saturation), dialized against PBS pH 7.3 followed by ultrapure wate, obtaining 71.3 mg of semi-purified anti-DON, used for development of enzyme linked immunossorbent assay indirect competitive ELISA (ic-ELISA) and immunoaffinity column (IAC). ic-ELISA was standardized in the following conditions: 2 &#956;g/mL DON-HG-BSA, anti-DON (1.25 mg/mL) diluted to 1:200 and HRP-labeled goat IgG diluted to 1:2000, detection limit was 177.12 &#956;/kg. The ic- ELISA performance was evaluated by high performance liquid chromatografy (HPLC) and HPLC-mass spectrometry (HPLC-MS). The analysis of 34 wheat samples from Paraná and Rio Grande do Sul states (2006, 2007 and 2008 crops) demonstrated reliability and efficiency of ic-ELISA, with IAC-HPLC correlation coefficient of 0.84. DON was detected in 24 samples (70.6 %) by IAC-HPLC (ND to 1531.51 &#956;g/kg) and 17 samples (50.0 %) by ic-ELISA (ND to 1362.1 &#956;g/kg), with ELISA/IAC-HPLC relation of 0.68. The analysis of 44 samples by HPLC-MS demonstrated high correlation with ic-ELISA (r= 0.93). DON was detected in 22 samples (50.0 %) by HPLC-MS (ND to 9906.9 &#956;g/kg) and 31 samples (71.4 %) by ic-ELISA (ND to 12291.4 &#956;g/kg), with relation ELISA/HPLC-MS of 1.64. DON recovery in artificially contaminated samples ranged from 26.9 % (wheat germ) to 108.4 % (wheat grain). The extraction methodology and later ic-ELISA analysis was satisfactory for samples of wheat grain and wheat flour. Wheat kibbe samples presented high relative standard deviation. Summary, survey of DON by ic-ELISA in 136 wheat grain samples, obtained from trial fields and wheat producers, from 2006, 2008 and 2008 crops revealed the presence of DON in 67.6 %, mean level 2140.2 &#956;g/kg, levels over positive samples ranging from 206.3 to 16076.5 &#956;g/kg. Eighty samples (58.8 %) presented lower levels than maximum level permited by European Commision for cereals for human consume (< 1750 &#956;g/kg). Samples from Parana exhibited lower levels (845.7 &#956;g/kg) when compared to Rio Grande do Sul (3163.8 &#956;g/kg). Differences in DON levels were also observed among the States regions and three crops analyzed. Regard 44 samples obtained from different steps of wheat processing (reception grains, clean wheat, moist wheat, flour, germ and bran), 16 (36.4 %) presented positive levels by ic-ELISA (ND to 4262.37 &#956;g/kg). analyzing 22 kibbe samples collected in Paraná commercial stablishments by the Sanitary Surveillence inspectors, DON was detected in 10 samples (45.4 %), mean 166.1 &#956;g/kg (ic-ELISA). To evaluate intake habits of wheat and wheat products, a Food Frequency Questionnaire was applied in Londrina, Paraná, Brazil (270 persons, based on 447000 inhabitants and 6 % sampling error). Pasta and bread were the most consumed wheat derivatives and a correlation between wheat products intake, social-demographic and anthropometric data were observed. Estimated Daily Intake (EDI) was calculated considering DON level in 76 wheat grain samples from Paraná and processing factors. The EDI of DON regard bread and pasta consumption was 0.82 &#956;g/kg body weight/day, 85 (32.7 %) individuals are above Provisional Tolerable Daily Maximum Intake settled in 1 &#956;g/kg b.w./day. The making of 4 immunoaffinity columns prototypes was not concluded with success, due to absence on DON retention by antibodies. The results of DON occurrence in wheat and EDI pointed to the necessity of toxin production control on field level, since processing methods actually used do not promote DON diminish and/or detoxification, and the DON intake could cause toxic effects in the population. Future expectatives promised the utilization of this mAb produced as a tool for immunossensors development, contributing to methodological advance through quality control automation, improving food safety