Imobilização de lipase extracelular de Beauveria bassiana em sílica gel por adsorção física

Este trabalho teve como objetivo estudar a imobilizacao de lipase produzida pelo fungo entomopatogenico Beauveria bassiana em diferentes carreadores. Oito cepas de B. bassiana (CG481, CG432, CG71, CG152, Unioeste 4, Unioeste 40, Bbio44 e Bbio61) foram testadas quanto a capacidade produtora de lipase em cultivos submersos em meio de Vogel acrescido de oleo de oliva 1%, ureia 1,5%, CaCl2 0,1% e Triton X-100 0,1%, durante 4 dias, 28oC, 200 rpm. O extrato bruto obtido do cultivo de B. bassiana CG481 foi ultrafiltrado (membrana 100kDa) e testado para imobilizacao de lipase em treze diferentes tratamentos: adsorcao em suportes inorganicos (Al2O3, CaCO3, CaSO4.2H2O, celite 545, silica gel), ligacao iônica (Amberlite MB-1 e Dowex com e sem tratamento com metanol), ligacao covalente com glutaraldeido (Amberlite MB-1 e Dowex) e aprisionamento em gel (alginato e alginato/gelatina). Silica gel foi selecionado como melhor suporte exibindo 94,8% de rendimento. Lipase de B. bassiana adsorvida em silica gel (ILS) manteve as condicoes ótimas de atividade da enzima livre (FL) (pH 8,5 e temperatura de 45°C), porem, ILS apresentou melhora da atividade lipolitica em valores elevados de pH (9,0-10,5) e temperatura (60°C). Alem disso, ILS mostrou aumento da estabilidade quando incubada em pH 7,0 por 120 h, com retencao de 69,0% da atividade inicial, enquanto FL exibiu apenas 33,3%. A estabilidade termica de FL e ILS foi avaliada na faixa de 30 a 60°C por 1 hora em meio aquoso e em solvente organico (somente ILS). A 60oC, ILS exibiu aumento da estabilidade termica tanto em meio aquoso (tampao Tris-HCl) (retencao de 64,6% de atividade residual) como em meio organico (n-heptano) (95,1%). Ja FL manteve apenas 40,6% da atividade inicial em meio aquoso e nao exibiu atividade em meio organico mesmo sem tratamento termico. O tratamento de ILS com NaCl 0,8 M preveniu a dessorcao de lipase enquanto Triton X-100 0,1% facilitou sua liberacao para o meio. ILS foi reutilizada por quatro ciclos de esterificacao, com duracao de 24 h cada, com manutencao de 80,8% da atividade inicial. O estudo envolvendo a imobilizacao de lipase produzidas por B. bassiana e inedito e os resultados obtidos abrem novas perspectivas para o emprego deste biocatalisador em processos biotecnologicos, inclusive em sistemas contendo solventes organicos como meio reacional.This work aimed to study the immobilization of lipase produced by the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana on different carriers. Eight strains of B. bassiana (CG481, CG432, CG71, CG152, Unioeste 4, Unioeste 40, Bbio44 and Bbio61) were tested for their ability to produce lipase in submerged cultures in Vogel salt broth added by 1% olive oil, 1.5% urea, 0.1% CaCl2 and 0.1% Triton X-100 during 4 days, 28oC, 200 rpm. The crude extract obtained from the Beauveria bassiana CG481 was ultrafiltered (100kDa membrane) and tested for lipase immobilization in thirteen different treatments: adsorption on inorganic supports (Al2O3, CaCO3, CaSO4.2H2O, celite 545, silica gel), ionic binding (Amberlite MB-1 and Dowex with and without treatment with methanol), covalent binding (Amberlite MB-1 and Dowex) and gel entrapment (alginate and alginate/gelatin). Silica gel was selected as the best support displaying 94.8% of activity yield. B. bassiana lipase adsorbed on silica gel (ILS) maintained the optimum conditions of activity of free lipase (FL) (pH 8.5 and temperature of 45 °C). However, ILS improved the lipolytic activity in higher values of pH (9.0-10.5) and temperature (60°C). In addition, ILS has shown increased stability when incubated at pH 7.0 for 120 h, with retention of 69.0% of initial activity, while FL showed only 33.3%. The thermal stability of FL and ILS was evaluated at the range of 30 to 60° C for 1 hour in aqueous medium and organic solvents (only for ILS). At 60oC, ILS exhibited increased thermal stability both in aqueous (TRIS-HCl) (64.6% residual activity) and in organic liquids (n-heptane) (95.1%). FL remained only 40.6% of initial activity in aqueous medium and exhibited no activity in organic medium. The treatment of ILS with 0.8 M NaCl prevented desorption of lipase while 0.1% Triton X-100 facilitated their release to the reaction environment. ILS was reused for four cycles of esterification reaction (24 h incubation each) and maintenance 80.8% of initial activity. The study involving the immobilization of B. bassiana lipase is unpublished and these results open new perspectives for the use of this biocatalyst in biotechnological processes, including systems containing organic solvents as reaction media