Nitric oxide mechanisms of action in an experimental model of UVB radiation on the skin of mice

A irradiação UVB estimula a produção de radicais livres causando lesões oxidativas na pele que podem resultar na aceleração do envelhecimento e o desenvolvimento de doenças cutâneas malignas. O presente estudo avaliou o estresse oxidativo e nitrosativo na pele de camundongos após a irradiação UVB e determinou as espécies reativas formadas imediatamente, 6hs e 24hs após a radiação UVB. Além disso, demonstrou o mecanismo de ação do óxido nítrico (NO) na lesão cutânea e na modulação da proliferação celular. Ainda com o objetivo de estabelecer o modelo experimental de irradiação aguda por UVB eficiente para testes com antioxidantes avaliamos o mecanismo protetor da genisteína, neste modelo experimental. Neste estudo para que os níveis de NO fossem avaliados foi necessário adaptar e validar uma técnica por quimiluminescência (QL) utilizada anteriormente por outros autores em tempo real em rim e coração para amostras congeladas e a fresco de pele de murinos. A técnica descreve a reação entre o NO e H2O2-luminol. Durante a validação, utilizamos além da pele, músculo gastrocnêmio de ratos e dois sistemas químicos geradores de NO (Nitroprussiato de sódio- NPS e iodeto de potássio em meio ácido). Através do uso de cPTIO (inibidor de NO), foi confirmado que o NO é de fato a molécula que reage com H2O2-luminol durante a reação de QL, observado pela inibição da emissão de fótons em todos os sistemas estudados. Durante a reação do NO e H2O2-luminol, utilizamos também os inibidores histidina, manitol e superóxido dismutase (SOD), específico para 1O2, radical hidroxil (OH) e ânion superóxido (O2 ), respectivamente e observamos que os resultados obtidos nos sistemas químicos e biológicos foram semelhantes aos descritos por outros autores. Conforme descrito as espécies emissoras de fótons, resultantes da reação entre o NO e H2O2-luminol, são o peroxinitrito (ONOO-) ou oxigênio singlet (1O2). Concluímos que a reação rápida, sensível e específica do NO com H2O2-luminol por QL, acontece em sistema químico e biológico e pode ser utilizado para examinar o papel do NO em processos fisiopatológicos, ampliando a utilização deste método para diferentes amostras à fresco e congeladas. Ainda neste estudo utilizamos outras metodologias descritas anteriormente através da reação de QL avaliamos o estresse oxidativo ou nitrosativo após a radiação aguda por UVB na pele pela formação de lipoperóxidos de membrana resultante da reação lipoperoxidativa iniciada por radicais livres e a capacidade antioxidante total (TRAP) do tecido. A atividade da enzima catalase (CAT) e níveis de glutationa reduzida (GSH) e oxidada (GSSG) foram analisadas por espectrofotometria. O estudo da modulação na proliferação celular foi realizado por imunohistoquímica através dos marcadores, PCNA, VEGF, Ki67, p53 e marcação da apoptose (Tunel). Os resultados mostraram a formação de lipoperóxidos de membrana na pele imediatamente após a radiação UVB, com níveis superiores após 24hs sendo que após 6hs não ocorreu lesão lipoperoxidativa. A redução da capacidade antioxidante total da pele foi observada somente imediatamente após a radiação UVB. Quando os animais swiss foram tratados com desferroxamina (DFX, quelante de ferro inibindo formação●OH), histidina (inibidor 1O2), AG e L-Name (inibidores de iNOS e cNOS, respectivamente), houve diminuição da formação de lipoperóxidos de membrana imediatamente após a radiação UVB. A redução da capacidade antioxidante total só não foi revertida com o tratamento com inibidores de NOS. Concluímos que imediatamente após a radiação UVB, diferentes espécies reativas, como o ●OH, 1O2 e NO participam do estresse oxidativo e nitrosativo na pele de camundongos swiss. A intensa lesão lipoperoxidativa após 24hs da UVB foi acompanhada por altos níveis de NO. Ainda neste tempo, houve redução da atividade da CAT e dos níveis de GSH, com aumento da GSSG, sugerindo acúmulo de H2O2. Este acúmulo resultou na reação entre H2O2 e NO gerando ONOO-, que é a espécie reativa responsável pela nitração de proteínas, conforme observado pela intensa marcação de nitrotirosina neste tempo. A análise histológica dos camundongos hairless tratados com AG e L-Name mostrou preservação tecidual que pode ser confirmada pela diminuição dos lipoperóxidos de membrana, na marcação da nitrotirosina assim como nos níveis de NO e proporcionou o aumento da proliferação celular avaliada pelo aumento dos marcadores PCNA e VEGF. Concluímos que após 24hs da radiação UVB, o NO é principal responsável pelo estresse nitrosativo na pele de camundongos hairless e swiss, bem como pela modulação da proliferação celular. O tratamento com genisteína (10 mg/kg) antes da radiação UVB mostrou pela análise histopatológica preservação tecidual sendo que a superfície epitelial permaneceu intacta. A ação protetora da Genisteína contra a lesão na pele após 24hs da radiação UVB, foi confirmada pela redução na formação de lipoperóxidos de membrana e na marcação da nitrotirosina embora os níveis de NO permanecessem elevados. Houve estimulação na proliferação celular avaliada pelo PCNA, VEGF, Ki67, p53 e diminui a apoptose. Estes resultados revelaram que a genisteína possui ação protetora contra o estresse nitrosativo na pele após 24hs da radiação UVB, provavelmente pela sua ação scavenger de H2O2 evitando a formação de ONOO-. Neste estudo mostramos a importante participação do NO na patogenia da pele provocada pela radiação UVB e sugerimos este modelo experimental para a avaliação dos mecanismos protetores de substâncias antioxidantes.UVB light stimulates production of reactive species that are the main cause of skin lesions and result in accelerated aging and the development of malignant skin diseases. The aim of this study was to evaluate the oxidative and nitrosative stress after UVB irradiation in the skin of hairless mice and swiss, and to determine the reactive species formed in the skin immediately (0h), 6hs and 24hs after UVB radiation, demonstrating the important role of nitric oxide ( NO) in the skin injury and the modulates on cell proliferation, as well as, the skin protects by the use of a known antioxidant, genistein, in this experimental model. To evaluate the lipoperoxidative lesion in hairless and swiss mice skin subjected to acute UVB radiation, a technique used was the chemiluminescence (CL) reaction, induced by tert-butyl hydroperoxide. Total antioxidant capacity (TRAP) was assessed by QL while the activity of the enzyme catalase (CAT) and reduced glutathione (GSH) and oxidized (GSSG) by spectrophotometry. The levels of nitric oxide (NO) to the skin was also investigated by QL, describes a system that NO reacts with luminol-H2O2. The study of cell proliferation was performed by immunohistochemistry using the markers, PCNA, VEGF, Ki67, p53 and apoptosis marking (Tunnel). The animals were treated (i.p.) with deferoxamine (DFX), iron chelator, to characterize the participation of the hydroxyl radical (OH●), histidine, "scavenger" of singlet oxygen (1O2), and aminoguanidine (AG) and L-name, inhibitors of iNOS and cNOS, respectively.The results showed the moderate formation of lipoperoxides in the skin immediately after UVB radiation, while after 24 hours there was a important lipid peroxidation, estimated by high light emission during the CL reaction. Six hours after UVB radiation the lipoperoxidative lesion was not observed. Immediately after UVB radiation, all the treatment of animals (DFX, histidine, L-NAME, AG) inhibited the light emission and decreased the total antioxidant capacity which was not reversed by treatment with NOS inhibitors (AG, L-NAME), indicating the ROS involvement. The lipoperoxidation observed 24 hours after UVB radiation was accompanied by high levels of NO. In addition, there was a reduction of CAT activity and GSH levels, with increases of GSSG levels, suggesting an accumulation of H2O2 and possible reaction with NO to generate ONOO-, a highly oxidizing specie, which can cause lipid peroxidation and nitrotyrosine formation. The impairment of cell proliferation was also observed. The protective action of Genistein against the skin lesion was demonstrated by the reduction in nitrotyrosine formation and lipid peroxidation as well as stimulated the cell proliferation and decreases apoptosis.In conclusion, immediately after UVB radiation differents reactive species, such as the ●OH, 1O2 and NO participates of the moderate oxidative and nitrosative stress observed in mice skin. After 24hs of UVB radiation, NO is mainly responsible for oxidative stress in hairless and swiss mice skin and nitrosative stress, as well as by modulation of cell proliferation. The Genistein has protective action against nitrosative stress in the skin, probably due to its action of H2O2 scavenger preventing the ONOO- formation . This study showed the important role of NO in the pathogenesis of the skin caused by UVB radiation and suggest that the anti-nitrosative effect must be considered in photoprotection researches. The objective of this study was also validate the technique used to assess the NO levels by QL in the mice skin, for frozen and fresh samples, since the method has only been used previously in biological systems in real time. To validate the techinic was used muscle gastrocnemius rats, two chemical systems (NO donors) sodium nitroprusside (NPS solution) and potassium iodide in acid medium (KINaNO3/ H2SO4 system) and specific inhibitors of NO, 1O2, ●OH, and superoxide anion (O2 ), cPTIO, histidine, mannitol and superoxide dismutase (SOD), respectively. cPTIO added in the mixture reaction, inhibithed the light emission of CL reaction in chemical and biological systems, confirming that NO is in fact the molecule that reacts with H2O2-luminol-CL system. As described by other authors, the light-emitting species, resulting from the reaction between NO and H2O2-luminol- CL system, are peroxynitrite (ONOO-) or 1O2. Specific reactive species inhibitors added in the misture reaction, showed similar effects on the light emission of CL curves in the chemical system comparing to biological system and those previously described by other authors. We conclude that and H2O2-luminol-CL system is a fast, sensitive and specific method to assess the NO levels and can be used to examine the role of NO in pathophysiological processes, expanding the use of this method for in fresh and frozen differents samples