Characterization of rhizobia isolated from soybean in Mozambique and strategies to maximize the contribution of biological nitrogen fixation

A inoculação da soja com estirpes de rizóbios eficientes no processo de fixação biológica de nitrogênio (FBN) torna dispensável o uso de fertilizantes nitrogenados nos trópicos. Um problema frequentemente relatado é a falta de capacidade de estirpes identificadas como elite e usadas em inoculantes comerciais em superar a competição imposta pelas populações indígenas ou naturalizadas de rizóbios. A seleção de rizóbios indígenas, adaptados às condições locais, com alta eficiência para o uso em inoculantes representa uma estratégia promissora para evitar fracassos na inoculação. Por outro lado, as fortes evidências de sucesso de inoculação em áreas com populações altas de rizóbios publicadas no Brasil abrem uma oportunidade para a pesquisa sobre inoculação em outras regiões geográficas no mundo. Assim, os objetivos desta tese foram: 1) Caracterizar estirpes indígenas de rizóbio e identificar estirpes com potencial para serem incluídas em inoculantes para variedades de soja tanto de nodulação promíscua como não promíscua nas condições agroclimáticas de Moçambique; 2) Avaliar o desempenho de quatro estirpes elite brasileiras (SEMIAs 587, 5019, 5079 e 5080) e uma norte-americana (USDA 110) no Brasil e em Moçambique. Para o primeiro objetivo, 105 isolados foram obtidos de nódulos de soja promíscua cultivada em 15 locais, em Moçambique, e avaliados pela eficiência simbiótica na casa de vegetação, juntamente com quatro estirpes usadas em inoculantes no Brasil, Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079, B. diazoefficiens SEMIA 5080, B. elkanii estirpes SEMIA 587 e SEMIA 5019, e uma estirpe usada na África, B. diazoefficiens USDA 110. Oitenta e sete isolados confirmaram a habilidade de formar nódulos efetivos em fixar N2 com a soja e foram usados na caracterização genética, por rep-PCR (BOX) e sequenciamento do gene 16S rRNA, e eficiência simbiótica. Os perfis obtidos por BOX - PCR revelaram uma notável diversidade genética com 41 agrupamentos formados, considerando o nível arbitrário de similaridade de 65%. A análise do gene 16S rRNA posicionou os isolados nos clados Bradyrhizobium (75%) e Agrobacterium Rhizobium (25%). Variabilidade elevada no desempenho simbiótico foi observada entre os isolados indígenas de Moçambique com dez isolados tendo melhor desempenho que USDA 110, a melhor estirpe de referência, e 50 isolados tendo menor desempenho que todas as estirpes de referência. Treze dos isolados mais eficientes foram avaliados, juntamente com as cinco estirpes de referência, em duas variedades promíscuas (TGx 1963-3F e TGx 1835-10E) e uma não promíscua (BRS 284) de soja, em um segundo ensaio de casa de vegetação. Os 13 isolados também foram caracterizados quanto à tolerância à acidez e alcalinidade (pH 3,5 e 9,0, respectivamente), salinidade (0,1, 0,3 e 0,5 mol L&#8722;1 de NaCl) e temperaturas altas (35, 40 e 45 ºC) in vitro. Cinco isolados, três (4, 19 e 22) pertencentes ao sub-grupo B. elkanii e dois (27 e 61) ao sub-grupo B. japonicum, mostraram, consistentemente, alta eficiência de fixação de N2, sugerindo que a inoculação com estirpes indígenas de rizóbios adaptadas às condições locais representa uma estratégia possível para a produção de soja em Moçambique. Para o segundo objetivo, as cinco estirpes de referência testadas no primeiro estudo foram avaliadas nas safras 2013/2014 e 2014/2015 no Brasil (quatro locais) e em Moçambique (cinco locais), em solos com populações de rizóbios compatíveis com soja, variando de < 10 a 2×105 células g&#8722;1 solo. Os ensaios foram conduzidos com variedades não promíscuas de soja e os seguintes tratamentos: (1) NI, controle não inoculado e sem N-fertilizante; (2) NI+N, controle não inoculado e com 200 kg de N ha&#8722;1; e, inoculado com (3) B. japonicum SEMIA 5079; (4) B. diazoefficiens SEMIA 5080; (5) B. elkanii SEMIA 587; (6) B. elkanii SEMIA 5019; (7) B. diazoefficiens USDA 110; (8) SEMIAs 5079 + 5080 (tratamento avaliado somente no Brasil). A nodulação, crescimento de plantas e rendimento foram avaliados em ambos países. Os melhores tratamentos com inoculação no Brasil, considerando a média dos locais e safras, foram com as estirpes SEMIAs 5079 + 5080, SEMIA 5079 e USDA 110, com ganhos médios de rendimento de grãos de 45% em relação ao tratamento NI. As estirpes SEMIA 5079, SEMIA 5080, SEMIA 5019 e USDA 110 foram as melhores em Moçambique, com ganhos médios de rendimento de 2029% em relação ao tratamento NI. Adicionalmente, as quatro estirpes com melhor desempenho em Moçambique resultaram em rendimentos semelhantes ou melhores do que o tratamento NI+N, confirmando a FBN como uma alternativa sustentável aos N-fertilizantes, poluidores ambientais. Os resultados também confirmam a viabilidade da transferência de tecnologias relacionadas à FBN com a soja entre países com condições agroclimáticas similares.Soybean inoculation with effective rhizobial strains makes unnecessary the use of nitrogen fertilizers in the tropics. A frequently reported problem is the failure of the inoculant strain to overcome the competition imposed by indigenous or naturalized rhizobial populations. The screening of indigenous rhizobia, adapted to local conditions, for highly effective strains for use as inoculants represents a promising strategy in overcoming inoculation failure. On the other hand, the strong evidences of inoculation success in areas with high rhizobial populations in Brazil open a window for inoculation research in other geographic regions in the world. Therefore, the objectives of this thesis were: 1) To characterize indigenous rhizobia and to identify strains that hold potential to be included in inoculant formulations for soybean production, with both promiscuous and non-promiscuous varieties, in Mozambican agro-climatic conditions; 2) To compare the performance of four elite strains from Brazil (SEMIAs 587, 5019, 5079 and 5080) and another strain from the US (USDA 110) in trials carried out with non-promiscuous soybean varieties in Brazil and Mozambique. For the first objective, 105 isolates were obtained from nodules of promiscuous soybean grown at 15 sites in Mozambique and screened for N-fixation effectiveness in the greenhouse along with four strains used in inoculants in Brazil, Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079, B. diazoefficiens SEMIA 5080, B. elkanii strains SEMIA 587 and SEMIA 5019, and one strain used in Africa, B. diazoefficiens USDA 110. Eighty-seven isolates confirmed the ability to form effective nodules on soybean and were used for genetic characterization, by rep-PCR (BOX) and DNA sequencing of the 16S rRNA gene, and symbiotic effectiveness. The BOX-PCR fingerprinting revealed remarkable genetic diversity, with 41 clusters formed, considering an arbitrary similarity level of 65%. The 16S rRNA analysis assigned the isolates to the Bradyrhizobium (75%) and Agrobacterium Rhizobium (25%) clades. Great variability in symbiotic effectiveness was detected among the indigenous rhizobia from Mozambique with ten isolates performing better than USDA 110, the best reference strain, and 50 isolates with lower performance than all the reference strains. Thirteen of the isolates with the highest symbiotic effectiveness were evaluated, along with the five reference strains, in two promiscuous (TGx 1963-3F and TGx 1835-10E) and one non-promiscuous (BRS 284) soybean varieties in a second greenhouse trial. The 13 isolates were also characterized for tolerance to acidity and alkalinity (pH 3.5 and 9.0, respectively), salinity (0.1, 0.3 and 0.5 mol L&#8722;1 of NaCl) and high temperatures (35, 40 and 45 ºC) in vitro. Five isolates, three (4, 19 and 22) belonging to the sub-group B. elkanii and two (27 and 61) assigned to the sub-group B. japonicum, consistently showed high symbiotic effectiveness, suggesting that the inoculation with indigenous rhizobia adapted to local conditions represents a possible strategy for soybean production in Mozambique. For the second objective, the five reference strains tested in the first study were evaluated in the 2013/2014 and 2014/2015 crop seasons in Brazil (four sites) and Mozambique (five sites). In both countries, the trial sites were in tropical and temperate climate zones and the areas had soybean rhizobial population ranging from < 10 to over 1×103 cells g&#8722;1 of soil. The treatments were: (1) NI, non-inoculated control with no N-fertilizer; (2) NI+N, non-inoculated control with 200 kg of N ha&#8722;1; and inoculated with (3) Bradyrhizobium japonicum SEMIA 5079; (4) B. diazoefficiens SEMIA 5080; (5) B. elkanii SEMIA 587; (6) B. elkanii SEMIA 5019; (7) B. diazoefficiens USDA 110; (8) SEMIAs 5079 + 5080 (treatment only tested in Brazil). The best inoculation treatments across sites and crop seasons in Brazil were SEMIAs 5079 + 5080, SEMIA 5079 and USDA 110, with average grain yield gains of 45% in relation to the NI treatment. Strains SEMIA 5079, SEMIA 5080, SEMIA 5019 and USDA 110 were the best in Mozambique, with average 2029% grain yield gains over the NI treatment. Moreover, the four best performing strains in Mozambique resulted in similar or better yields than the NI+N treatment, confirming the BNF as a sustainable option to the use of environmentally polluting N-fertilizers. The results also confirm the feasibility of transference of technologies related to BNF with soybean between countries with similar agro-climates