Semi-nested PCR para a detecção molecular do fungo Paracoccidioides brasiliensis

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico e agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica endêmica na América Latina. A PCM é rotineiramente diagnosticada pela observação direta das células do fungo, por cultura celular ou ainda por métodos sorológicos. Entretanto, essas técnicas apresentam limitações que podem levar a atrasos para o início do tratamento ou mesmo a resultados falso negativos. Neste estudo foi desenvolvida uma reação de semi-nested PCR para a detecção do DNA de P. brasiliensis, utilizando a seqüência do DNA ribossomal como alvo. Inicialmente, amostras de DNA de P. brasiliensis (cepas Pb18 e LDR1) e de outros fungos patogênicos foram extraídas e usadas para se determinar o limite de detecção da reação e a ocorrência de reações cruzadas. Para avaliar a reação de semi-nested, ela foi comparada com os métodos de cultivo e histopatologia quanto à capacidade de detecção de P. brasiliensis Pb18 em amostras de tecidos de camundongos experimentalmente infectados. E ainda, a reação desenvolvida neste trabalho foi utilizada para a detecção do fungo em amostras de biópsia bucal de pacientes com suspeita de PCM e solo de tocas de tatu e formigueiros. Na tentativa de otimizar a reação foi desenvolvida uma semi-nested PCR em uma única etapa. A semi-nested PCR mostrou-se específica para P. brasiliensis e o limite de detecção foi de 2,5 pg de DNA ou 10 células do fungo. No estudo comparativo a semi-nested PCR e a histopatologia foram positivas para todas as amostras de animais infectados, inclusive quando parafinadas, enquanto que a cultura foi positiva apenas para 60% das amostras. A semi-nested PCR também foi positiva para as 4 amostras de pacientes com PCM e para duas amostras de solo, uma de toca de tatu e outra de formigueiro. A semi-nested PCR em um tubo foi específica para P. brasiliensis, porém, com um limite de detecção de 0,25 ng de DNA. Este estudo mostrou a alta sensibilidade e especificidade dessa nova reação de semi-nested PCR para a detecção molecular de P. brasiliensis em amostras de biópsias, em tecidos embebidos em parafina e mesmo do solo.Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus and the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis endemic in Latin America. PCM is routinely diagnosed by direct observation of fungi cells, by culture or serological tests. However, these techniques present limitations that could result in delay for the beginning of treatment or even false negatives results. In this study a semi-nested PCR assay for the detection of P. brasiliensis was evaluated, using sequences of the rDNA as a target. Initially, DNA samples of two P. brasiliensis isolates (LDR1 and Pb18) and other pathogenic fungi were extracted and used to determine the limit of detection and cross-reactivity. To evaluate the semi-nested PCR assay, it was compared to culture and histopathology methods in detecting P. brasiliensis Pb18 in tissue samples of experimentally infected mice. Furthermore, the assay developed in this study was used for the fungus detection in oral biopsy specimens of patients with a PCM suspect and in soil of armadillo?s burrow and ant-hill. To improve the reaction a one tube semi-nested PCR was also padronized. The semi-nested PCR assay was specific for P. brasiliensis and the detection limit was 2,5 pg of DNA or 10 fungi cells. In the comparative study, the semi-nested assay and histopathology were positive for all infected samples, including the paraffin-embedded ones, while only 60% were positive by cellular culture. The semi-nested PCR assay was also positive for 4 PCM patients? samples and in two environmental samples, one from an armadillo burrow and the other one from an ant-hill. One tube semi-nested PCR was specific for P. brasiliensis, however, with a detection limit of 0,25 ng of DNA. This study showed the high sensitivity and specificity of this new semi-nested PCR assay for the detection of P. brasiliensis in fresh and paraffin-embedded tissues, and soil