Papel antagônico das isoformas óxido nítrico sintase constitutiva (cNOS) e induzida (iNOS) em camundongos nocautes para 5-lipoxigenase infectaves com Trypanosoma cruzi

Durante a infeccao por Trypanosoma cruzi, causador da doenca de Chagas, o principal mecanismo efetor contra o parasita consiste na producao de oxido nitrico (NO) por macrofagos ativados pelo IFN-γ, TNF-α e leucotrienos. Animais deficientes em oxido nitrico sintase induzivel (iNOS) apresentam aumento da susceptibilidade a infeccao, com elevada parasitemia e queda da sobrevida. Neste estudo, investigamos o papel das isoformas oxido nitrico sintase constitutiva (cNOS) e induzivel (iNOS) em camundongos nocautes para 5-lipoxigenase (5-LO) no curso da infeccao aguda por T. cruzi. Camundongos isogenicos selvagens (129 WT) e nocautes para a producao de leucotrienos (5-LO-/-) foram infectados intraperitonialmente com 5 x 103 formas tripomastigotas sanguineas e tratados com inibidores farmacologicos para cNOS (L-NAME) e iNOS (aminoguanidina), 4 horas apos inicio da infeccao, durante 12 dias para obtencao das amostras de plasma e por 30 dias para avaliacao da carga parasitaria e sobrevida. Os parametros avaliados foram: determinacao da carga parasitaria, sobrevida, parasitismo cardiaco, producao de nitrito (como estimativa da producao de NO) plasmatico e perfil de citocinas durante a infeccao. Para determinacao dos niveis de NO, realizou-se a adaptacao, padronizacao e validacao de uma tecnica para dosagem de nitrito plasmatico, partindo-se da desproteinizacao das amostras e tratamento com esferas de cadmio sensibilizadas com cobre para conversao do nitrato a nitrito, com posterior deteccao pela reacao de Griess. Este micrometodo mostrou-se adequado e sensivel para a deteccao de nitrito em plasma e soro de camundongos, apresentando caracteristicas como facil execucao, baixo custo e rapidez na obtencao de resultados. Em relacao a infeccao por T. cruzi, o bloqueio da iNOS com aminoguanidina promoveu aumento significativo da carga parasitaria e reducao da sobrevida em ambas linhagens de camundongos, sendo este efeito mais pronunciado nos animais nocautes para 5-LO, indicando que o controle da carga parasitaria mediado pelo NO (via iNOS) e parcialmente dependente de leucotrienos. Neste estudo demonstrou-se pela primeira vez a participacao da cNOS no controle da carga parasitaria e a producao de NO na ausencia da 5-LO durante a fase aguda da infeccao experimental por T. cruzi. O bloqueio com L-NAME levou a reducao da carga parasitaria sanguinea e cardiaca em relacao aos animais infectados nao tratados nas duas linhagens, sugerindo que a presenca da cNOS exerce um efeito modulador favoravel ao parasita. A iNOS e uma importante fonte de producao de NO durante a infeccao, ja que seu bloqueio provocou queda nos niveis de NO plasmatico em ambas linhagens. O bloqueio da cNOS levou a reducao da producao de NO apenas na ausencia de 5-LO, indicando que a cNOS e uma importante fonte de NO na ausencia de leucotrienos. O perfil de citocinas observado foi influenciado pela 5-LO, tanto nas condicoes basais como durante a infeccao por T. cruzi. Adicionalmente, os resultados demonstram que a o bloqueio das enzimas iNOS e cNOS promovem alteracoes importantes nos niveis de citocinas dos padroes Th1 e Th2 produzidas na fase aguda da infeccao. Finalizando, nossos dados evidenciam pela primeira vez a existencia de acoes antagônicas exercidas pelas enzimas iNOS e cNOS no circuito complexo formado por leucotrienos, oxido nitrico e citocinas pro-inflamatorias durante a fase aguda da infeccao com o protozoario T. cruzi.During Trypanosoma cruzi infection, causative agent of Chagas disease, the major effector mechanism against parasite is the production of nitric oxide (NO) by IFN-γ, TNF-α and leukotrienes activated macrophages. Nitric oxide synthase (iNOS) knockout mice showed increased susceptibility to infection, high parasitemia and reduction of survival. In the present study, we investigated the role of nitric oxide synthase isoforms, cNOS (constitutive isoform) and iNOS (inducible isoform) in 5-lipoxygenase knockout mice (5-LO-/-) during acute phase of T. cruzi infection. Isogenic wild type (129 WT) and knockout mice (5-LO-/-, deficient in leukotrienes production) were infected intraperitonially with 5 x 103 trypomastigotes forms and treated at different time intervals after T. cruzi infection with iNOS inhibitor (aminoguanidine) or cNOs inhibitor (L-NAME), initiated 4 hours after infection, during 12 days to plasma acquirement and 30 days to access blood parasitemia and survival rates. The parameters evaluated were: blood parasitemia, survival rates, cardiac parasitism, nitrite production (as estimative of NO levels) and cytokine profile. To determine NO levels, we adapted a method to detect nitrite in plasma, employing sample desproteinization and treatment with cadmium granules sensitized by copper to convert nitrate to nitrite and detect the formed product by Griess reaction. This micromethod showed adequability and sensitivity to detect nitrite levels in mice samples, also demonstrated that is fast (about 2 hours to perform 96 samples), easy, reliable, has low cost (because cadmium granules regenerate after use) and good sensitivity when tested in biological samples. During T. cruzi infection iNOS blockage showed an increase in blood parasitemia and reduction of survival rates in both mice, indicating that this isoform is necessary in parasite control. We showed for the first time cNOS participation in the course of infection. L-NAME treatment provoked reduction of blood parasitemia and number of amastigotes nests in all animals, suggesting that cNOS is an important mediator to the parasite burden during infection. iNOS is an important source of NO during infection because its blockage provoked reduction in NO levels to both mice strains . cNOS blockage decreased NO production, suggesting that cNOS is an important source of NO when leukotrienes are lacking. Cytokine profile was influenced by 5-LO in both basal levels and T. cruzi infection and the NOS inhibition promoted several changes in Th1/Th2 response during acute phase. Finally, our data showed for the first time antagonics actions exerted by iNOS and cNOS in the complex leukotrienes, NO and pro-inflammatory cytokines circuit during acute phase of T. cruzi infection