Immobilization of beta-glucosidases on agarose supports activated with different functional groups

As β-glicosidases hidrolisam ligações β-glicosídicas a partir da extremidade não redutora de oligossacarídeos e glicosídeos conjugados, e possuem largo espectro de aplicações biotecnológicas como, na estabilização e enriquecimento de bebidas a exemplo dos sucos e vinhos. Porém, estes processos são realizados em um meio com alta concentração de glicose, uma molécula com grande efeito inibitório das β- glicosidases. Deste modo, o presente trabalho visou desenvolver biocatalisadores imobilizados com atividade de β-glicosidase, capazes de serem aplicados em bebidas à base de uva. A imobilização desta enzima é uma ferramenta extremamente relevante para ultrapassar os desafios da sua aplicação industrial através da melhoria das suas características, como, um melhor controle operacional, e menor oneração. Inicialmente, as atividades de β-glicosidase de nove preparações enzimáticas comerciais foram comparadas avaliando-se os efeitos do pH, estabilidade térmica, parâmetros cinéticos e tolerância à glicose. O valor do pH do meio de reação influenciou fortemente as atividades, estabilidades, e inibição à glicose das β- glicosidases testadas. As preparações de Pectinex Ultra SP-L, Pectinex Utra Clear e Celluclast® 1,5 L, e o extrato enzimático de Aspergillus niger URM 6642 foram selecionadas com base em sua atividade de β-glicosidase e tolerância à glicose. Em seguida, a imobilização das enzimas selecionadas foram testadas em 5 diferentes suportes: MANAE, MANAE-glutaraldeído, glioxil-agarose, divinilsulfona-agarose e epóxi-agarose. A imobilização das β-glicosidases de Pectinex Ultra SP-L, Pectinex Utra Clear e de A. niger URM 6642 no suporte MANAE-agarose foram realizadas em pH 5, 7 e 9 para permitir diferentes orientações das moléculas da enzima na superfície do suporte, e, posteriormente, também modificadas com glutaraldeído. Os resultados demonstraram que o protocolo ideal para imobilizações de β-glicosidases, usando a o glutaraldeído, deve ser testado individualmente e adaptado para cada tipo de enzima. A imobilização das β-glicosidases de Pectinex Ultra SP-L e Celluclast® 1.5L em DVS-agarose também foram testadas nos pHs 5, 7, 9 e 10. Os resultados demonstraram que o pH de imobilização ocasionou forte influência nos rendimentos de imobilização, e afetou a estabilidade das enzimas e a tolerância à glicose. As enzimas também foram estudadas quanto a descoloração do suco de uva e do vinho tinto. Os resultados deste trabalho demonstraram que os biocatalisadores estudados possuem características promissoras, e, portanto, de grande importância para indústria.β-glucosidases hydrolyze β-glycosidic bonds from nonreducing terminal of oligosaccharides and conjugated glycosides, and have wide range of biotechnological applications such as, in the stabilization and enrichment drinks like juices and wines. However, these processes are carried out in a reaction medium with a high concentration of glucose, a molecule with high inhibitory effect on β-glucosidases. Thus, the present work aimed to develop immobilized biocatalysts with β-glucosidase activity subject to application in grape-based beverages. The immobilization of this enzyme is an extremely relevant tool to overcome the challenges of its industrial application through the improvement of its characteristics, such as higher operational control and lower cost. Initially, the β-glucosidase activities of nine commercial enzyme preparations were compared by evaluating the effects of pH, thermal stability, kinetic parameters, and glucose tolerance. The pH value of the reaction medium strongly influenced the activities, stabilities, and glucose inhibition of the β-glucosidases tested. The Preparations of Pectinex Ultra SP-L, Pectinex Utra Clear, Celluclast® 1.5 L, and a strain of Aspergillus niger URM 6642 were selected based on their β-glucosidase activity and glucose tolerance. Then, the immobilization of selected enzymes were tested on 5 different supports: MANAE, MANAE-glutaraldehyde, glyoxyl-agarose, divinylsulfone-agarose and epoxy-agarose. The immobilization of β-glucosidases from Pectinex Ultra SP-L, Pectinex Utra Clear and A. niger URM 6642 on the MANAEagarose support were carried out at pH 5, 7 and 9 to allow different orientations of the enzyme molecules on the support surface, and later also modified with glutaraldehyde. Results showed that optimal protocol for β-glucosidases immobilizations using the glutaraldehyde chemistry must be individually tested and tailored to each type of enzyme. The immobilization of β-glucosidases from Pectinex Ultra SP-L and Celluclast® 1.5L in DVS-agarose were also tested at pHs 5, 7, 9 and 10. The esults showed that the immobilization pH had a high influence on the immobilization yields. The change in immobilization pH also affected enzyme stability and glucose tolerance. Enzymes were also studied for discoloration of grape juice and red wine. The results of this work showed that the studied biocatalysts have promising characteristics, and therefore, of great importance for industry