Descrição de uma toxina semelhante à serpina nos venenos de Loxosceles (aranha marrom) : expressão recombinante em células de inseto e caracterização de atividades bioquímicas e biológicas

Orientador: Prof. Dr. Silvio Sanches VeigaCoorientadora: Profa. Dra. Luiza Helena GremskiTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 31/03/2021Inclui referências: p. 91-103Resumo: A toxinologia é a área da ciência que se dedica ao estudo das toxinas de animais como serpentes, aranhas, escorpiões, abelhas, vespas, entre outros animais, bem como, as características destas toxinas, suas funções, metabolismo, efeitos nocivos, tratamentos e aplicações biotecnológicas. Muitas toxinas já foram estudadas e trazem grande contribuição biotecnológica e farmacêutica para a humanidade, tendo como um exemplo, o fármaco captopril, cujo princípio ativo do medicamento teve origem em um peptídeo extraído do veneno da Bothrops jararaca. As serpinas são moléculas que são descritas no organismo e em venenos de diferentes espécies, como abelhas, serpentes e aranhas essas moléculas atuam como inibidores de serino protease, e participam de processos fisiológicos importantes, já bem entendidos na literatura. A proteólise não regulada de diferentes substratos pode levar ao surgimento de doenças como o câncer e a trombose, portanto, as funções desses inibidores são fundamentais para o bom funcionamento do organismo. Nesse trabalho foi identificado uma serpina extraída da glândula de veneno da aranha marrom Loxosceles intermedia, com aproximadamente 1197 pares de bases. Esta proteína foi clonada e produzida na forma recombinante, em um sistema eucarioto, usando a linhagem de células de inseto Sf9 e recebeu o nome de LSPILT (do Inglês Loxosceles Serine Protease Inhibitor-Like Toxin). Essa pesquisa é de grande relevância porque o conhecimento sobre o mecanismo de ação e da função da serpina do veneno da aranha marrom é limitado, visto que, essa é a primeira vez que uma serpina do gênero Loxosceles foi clonada e produzida na forma recombinante. A produção da LSPILT foi feita em células de inseto, e a purificação por cromatografia de afinidade em Níquel-Agarose, originando uma proteína solúvel com aproximadamente 46 kDa. Os ensaios de padronização da síntese dessa proteína mostraram que o fracionamento da adição da titulação viral foi imprescindível para o sucesso da produção em massa que resultou em 8 mg/mL. As análises bioquímicas foram feitas por SDS-PAGE e immunoblotting e ELISA mostrando conservação biológica desta molécula em diferentes venenos de espécies de Loxosceles. As avaliações bioquímicas e biológicas mostraram que a LSPILT inibe a degradação da gelatina na presença de tripsina, mostrou atividade inibitória frente a morte de T. cruzi causada por convertases do sistema complemento, inibiu a formação de trombo em plasma estimulada pela trombina, além de inibir a migração de células de melanoma (B16-F10). Os dados obtidos a partir desta pesquisa contribuem para a caracterização de uma serpina nos venenos de Loxosceles abrindo possibilidades de futuros estudos estruturais, compreensão da participação desta molécula no quadro do envenenamento e aplicações biotecnológicas.Abstract: Toxinology is the area of science dedicated to the study of toxins from animals such as snakes, spiders, scorpions, bees, wasps, among other animals, as well as the characteristics of these toxins, their functions, metabolism, harmful effects, treatments, and biotechnological applications. Many toxins have already been studied and brought a great biotechnological and pharmaceutical contribution to humanity. Captopril, for example, originated from a peptide extracted of the venom of Bothrops jararaca. Serpins are molecules that act as inhibitors of serine proteases, which are enzymes that participate in well understood and important physiological processes. The unregulated proteolysis of different substrates can lead to the appearance of diseases such as cancer and thrombosis. Therefore, the function of these inhibitors is essential for the proper functioning of the body. In this work was identified a sequence from the brown spider venom gland of Loxosceles intermedia that encodes a serpin, with approximately 1197 base pairs. This protein was cloned and produced as a recombinant protein in a eukaryotic system, using the Sf9 insect cell and was named LSPILT (Loxosceles Serine Protease Inhibitor-Like Toxin). This study is of great relevance because the knowledge about the mechanism of action and function of the brown spider venom serpin is limited since this is the first time that a serpin of the genus Loxosceles has been produced recombinantly. The main objective is the expression of the L. intermedia serpin, in a eukaryotic expression system, through the baculovirus/insect cells system, in addition to characterizing this molecule biochemically and investigating and evaluating its biological activities. The purification of LSPILT was performed by affinity chromatography in Nickel-Agarose originating a soluble and active protein with approximately 46 kDa. Initial assays for the synthesis of this protein showed that the fractioning of the addition of viral titration was essential for the success of mass production, which resulted in 8 mg/mL. Biochemical analyzes were assessed by SDS-PAGE, pointing that LSPILT was obtained in a pure form. Through immunoblotting and ELISA it was shown that LSPILT is a conserved molecule among different Loxosceles species. Biological evaluations pointed that LSPILT inhibits the degradation of gelatin in the presence of trypsin. In addition, LSPILT showed inhibitory activity of complement system convertases that induce the death of Trypanosoma cruzi, inhibited the coagulation induced by thrombin, and reduced the migration of melanoma B16-F10 cells. The data obtained from this research contribute to the characterization of a serpin and open the possibility of future structural and biotechnological studies