Sviluppo di metodi per l’isolamento e la stabilizzazione di oligomeri di catene leggere libere (FLC) da campioni biologici

La misurazione delle catene leggere libere k e λ (Free Light Chains, FLC) degli anticorpi nel siero è un parametro utile per la diagnosi e la valutazione prognostica delle discrasie plasmacellulari. Sono disponibili in commercio alcuni test per la quantificazione immunochimica automatizzata delle FLC, basati in alcuni casi su anticorpi policlonali come il test Freelite (The Binding Site), in altri casi su anticorpi monoclonali, come nel caso delle N Latex FLC (Siemens Healthineers). Il dosaggio con tali test però ha ottenuto in alcuni casi risultati discordanti sullo stesso campione. Dal momento che non è disponibile nessun materiale di riferimento internazionale per FLC non è possibile avere certezze sulla accuratezza dei test e questo costituisce un problema poiché la misura delle FLC rappresenta un parametro inserito in linee guida internazionali. Le FLC possono essere organizzate come monomeri e/o come dimeri: ciò potrebbe essere responsabile di una diversa esposizione degli epitopi e, quindi, della loro diversa reattività immunochimica. Al fine di chiarire se la discordanza dei risultati possa essere dovuta ad una diversa specificità dei reattivi, ci siamo proposti di mettere a punto delle metodiche che permettano la purificazione delle diverse forme di FLC per consentire una loro corretta quantificazione. Il campione di studio utilizzato per la messa a punto della procedura è un campione di urina che presenta un quantitativo elevato di FLC ed è quasi privo di altro materiale proteico. Prima dell’utilizzo le urine sono state dializzate in modo da liberare il campione da sostanze di piccole dimensione potenzialmente interferenti con la lettura in UV. L’elettroforesi su gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) consente la separazione dei monomeri e dei dimeri delle FLC contenute nel campione. Il peso molecolare consente di localizzarli per purificare separatamente monomeri e dimeri mediante elettroeluizione dalla banda del gel. Tali monomeri e dimeri – purificati e quindi quantificabili mediante UV - possono quindi essere separatamente dosati con le tecniche immunochimiche su piattaforma nefelometrica per valutare la specificità dei reattivi. Si è cercato, quindi, di mettere a punto delle tecniche per stabilizzare i dimeri e i monomeri purificati, questi ultimi in conformazione nativa o ridotta dopo esposizione ad agenti riducenti, seguita dal blocco dei sulfidrili. Per fare questo sono stati eseguiti numerosi esperimenti con diversi agenti riducenti ed agenti bloccanti. È stata anche utilizzata la tecnica FPLC per la valutazione qualitativa delle varie preparazioni