Role of protein kinase C (PKC) in the growth of B-cell acute lymphoblastic leukemia cells, in the support provided by mesenchymal stem cells and in their functionality in an in vitro model of leukemic niche.

gráficas, ilustraciones, tablasEl microambiente de la médula ósea (MO) impacta de manera importante la progresión de la leucemia, favoreciendo la supervivencia y la resistencia a la muerte celular. Las mesenchymal stem cells (MSC) constituyen una población celular importante del nicho hematopoyético de la MO, sin embargo, su funcionalidad se ve afectada de manera importante por el estrés celular inducido por el crecimiento de las células leucémicas, con consecuencias desfavorables para las células stem hematopoyéticas en favor de las células leucémicas. Se ha demostrado un papel de la proteína quinasa C (PKC) estromal en el soporte, supervivencia y proliferación de varios tipos de leucemia. Las alteraciones de las MSC en la leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) solo han sido estudiadas parcialmente. En este trabajo, se mostró que la inhibición específica de la PKC con un péptido quimérico HKPS induce una reducción de la viabilidad, entre un 45 y 60%, de las células leucémicas de pacientes con LLA-B. También, se estudiaron las modificaciones de las MSC en un nicho leucémico in vitro, y en MSC aisladas de pacientes con LLA-B. Las MSC mostraron características de un proceso senescente con pérdida de su morfología fibroblastoide con células aplanadas con aumento de su área citoplasmática, un aumento en la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-βGAL) y en la transcripción de los genes p53 y p21, también la detención del ciclo celular, una reducida clonogenicidad y la generación transitoria de especies reactivas de oxígeno (ROS) citosólico y mitocondrial, siendo las células leucémicas las reguladoras positivas para la inducción de este proceso. En particular, una disfunción moderada en las propiedades stemness, con una proliferación reducida, una pérdida de la capacidad de diferenciación osteoblástica y un aumento de la diferenciación adipogénica y, con un aumento en su capacidad de autorrenovación. Características reportadas en MSC senescentes que, se asocian con la inflamación y, la activación de la vía NF-B encontrada en el modelo in vitro. En este modelo se encontró que, el retiro de las células leucémicas del co-cultivo y el cultivo extendido de las MSC senescentes con un estímulo proliferante (SFB) induce el re-ingreso al ciclo celular y una disminución de la SA-βGAL, sugiriendo una reversión del fenotipo senescente con la reaparición parcial de las propiedades de stem. Además, solo una pequeña población de MSC acumuló daño al DNA por la fosforilación de H2AX que además se redujo a niveles basales después del cultivo. También se encontró un perfil claro de citoquinas y quimioquinas pro-inflamatorias (CCL2, IL-8, IL-6), característico de un fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP) en el NL, que fundamenta las acciones de las MSC en el microambiente leucémico a través de mecanismos paracrinos y el cual fue mediado por la actividad de la PKC. En conclusión, la afectación que sufren las MSC requiere de la presencia permanente de células leucémicas, y cuando se retira el estrés leucémico, las MSC retoman prácticamente a su funcionamiento normal. Estos hallazgos son de gran relevancia en la progresión de la enfermedad y en el tratamiento.(Texto tomado de la fuente)The bone marrow (BM) microenvironment influences dramatically leukemia progression by favoring survival and resistance to cell death. Mesenchymal stem cells (MSC) constitute an important cell population of the BM hematopoietic niche; however, most of their functions are significantly affected by cellular stress imposed by leukemic cell growth, with unfavorable consequences for hematopoietic stem cells in favor of leukemic cells. A role of stromal protein kinase C (PKC) in the support, survival and proliferation of various types of leukemia has been demonstrated. MSC alterations in B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) have only been partially studied. In this work, we showed that specific inhibition of PKC with a chimeric HKPS peptide induces a 45-60% reduction in viability of leukemic cells from B-ALL patients. Also, MSC modifications were studied in a leukemic niche (LN) in vitro, and in MSC isolated from B-ALL patients. MSC showed features of a senescent process with loss of their fibroblastoid morphology with flattened cells with increased cytoplasmic area and increase in senescence-associated β-galactosidase (SA-βGAL) activity and in the expression of p53 and p21 genes, cell cycle arrest, reduced clonogenicity and transient generation of intracellular and mitochondrial reactive oxygen species (ROS), with leukemic cells being the inducers and regulators of this process. A moderate dysfunction in stemness properties, with reduced proliferation, loss of osteoblastic differentiation capacity, increased adipogenic differentiation and an increase in their self-renewal capacity were also found. In the in vitro model, it was found that, removal of leukemic cells followed by further culture with a proliferating stimulus induced re-entry into the cell cycle and a decrease in SA-βGAL, suggesting a reversal of the senescent phenotype with partial reappearance of stem-like cell properties. Accordingly, only a small population of MSC accumulated DNA damage by H2AX phosphorylation which was reduced to basal levels after culture. A clear pro-inflammatory cytokine and chemokine profile characteristic of a senescence-associated secretory phenotype (SASP) was also found in the LN (CCL2, IL-8, IL-6), validating MSC role in the leukemic microenvironment through paracrine mechanisms and which was mediated by PKC activity. In conclusion, MSC impairment requires the presence of leukemic cells, and when leukemic stress is removed, MSC almost recovered normal function. These findings are of great relevance in disease progression and treatment.DoctoradoDoctor en Ciencias Biomédica