Identification and genetic mapping of new resistances against Plasmopara viticola from Asian and American wild species

Die Einschleppung des invasiven Rebenpathogens Plasmopara viticola gegen Ende des 19. Jahrhunderts, gefährdet bis heute den Bestand kultivierter Rebsorten der europäischen Weinrebe Vitis vinifera ssp. vinifera und führt zu erheblichen Ernteverlusten. Um den Einsatz an Pflanzenschutzmitteln zu reduzieren, stellt die gezielte Züchtung resistenter Sorten eine ökologische Methode zum Erhalt des Bestands und zur Sicherung des Ertrags dar. Bisher konnten mehrere Resistenzloci aus sowohl amerikanischen, als auch asiatischen Wildreben identifiziert werden. Da bereits für einzelne Isolate des Pathogens erste Hinweise einer Überwindung der Resistenz beobachtet werden konnten, ist das Erfassen und Kartieren neuer Resistenzloci für die Resistenzzüchtung essentiell. Im Rahmen dieser Arbeit konnten anhand von Quantitative trait loci (QTL)-Analysen ein stabiler und signifikanter Resistenzlocus (Rpv10.2), sowie multiple schwache QTLs gegen P. viticola identifiziert werden. Die QTL-Analysen basierten auf der Verrechnung phänotypischer Daten aus Infektionstests mit den genetischen Kopplungskarten der Kreuzungspopulationen ‘Tigvoasa’ x We 90-06-12 (TVxWe90) und ‘Cabernet Franc’ x ‘Triomphe d‘Alsace’ (CFxTA). Die Kopplungskarten wurden dabei anhand von Simple sequence repeat (SSR)- und RNase H2-dependent amplicon sequencing (rhAmpSeq)-Markern erstellt. Der Resistenzlocus Rpv10.2 konnte anhand eines signifikanten QTLs auf Kopplungsgruppe 09 für die Population TVxWe90 identifiziert werden. Die Elternsorte We 90-06-12 ist Nachkomme der asiatischen Wildart Vitis amurensis und fungierte als Donor einer bisher unbekannten Resistenz. Der eingegrenzte Bereich des Rpv10.2-Locus (ca. 80 kb auf dem V. vinifera Referenzgenom) wird von den SSR-Markern GF09-65 und GF09-47 flankiert und deckt sich mit dem bereits bekannten Rpv10-Locus aus der Sorte ‘Solaris’, die ebenfalls von V. amurensis abstammt (Schwander et al. 2012). Erste mikroskopische Analysen von Blattproben der Sorten We 90-06-12 und ‘Solaris’ zur Ausbreitung des Hyphenwachstums von P. viticola im Blatt, konnten auf ähnliche Resistenzeigenschaften hindeuten. Das Kandidatengen RPS5-like, das in Verdacht mit der Rpv10-vermittelten Resistenz steht (Zyprian et al., in preparation), konnte anhand von Sequenzanalysen in der Akzession We 90-06-12 ohne Unterschiede nachgewiesen werden. Ein weiteres Kandidatengen, AP2/ERF-like, zeigte allerdings Variationen in der Protein-codierenden Sequenz außerhalb der funktionellen AP2-Domäne. Des Weiteren konnten Markeranalysen wiederholt Unterschiede in der Resistenz-korrelierenden Allellänge der SSR-Marker (GF09-68, GF09-46 und GF09-48) aufweisen, die seit mehreren Jahren zur stabilen Identifikation von Rpv10-tragenden Sorten in der Züchtung eingesetzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit geben Hinweise auf eine Haplotyp-Variante (Rpv10.2) des Rpv10-Locus, die in neuen Züchtungen anhand der SSR-Marker GF09-68, GF09-46 und GF09-48 detektiert werden kann. Weitere Untersuchungen zur Charakterisierung des Rpv10.2-Locus können auf den Befunden dieser Arbeit aufbauen. Im Fall der Population CFxTA wurden multiple schwache QTLs erfasst, die lediglich auf den Kopplungsgruppen 12 und 17 reproduziert werden konnten. Die Bereiche der QTLs auf diesen Kopplungsgruppen erstrecken sich dabei jeweils über mehrere Megabasen auf dem V. vinifera Referenzgenom. Um Aussagen über die Relevanz der QTLs für die Züchtung zu treffen, können weitere Analysen mit Markern zur Eingrenzung der Bereiche durchgeführt werden. Vorab ist zu erwähnen, dass auf Kopplungsgruppe 17 bisher keine Resistenzloci gegen P. viticola publiziert wurden. Im Vergleich dazu konnte auf Kopplungsgruppe 12 unter anderem der Rpv6-Locus aus der Sorte ‘Riparia Gloire de Montpellier’ detektiert werden (Marguerit et al. 2009). ‘Riparia Gloire de Montpellier’ ist eine Selektion der amerikanischen Wildart Vitis riparia und ein Vorfahre der Sorte ‘Triomphe d’Alsace’, die als Resistenzdonor der Population CFxTA identifiziert wurde. Ob es sich im Fall des QTLs auf Kopplungsgruppe 12 um den Rpv6-Locus handelt, muss durch weitere Untersuchungen verifiziert werden. Anhand dieser Arbeit konnten erste Hinweise auf eine Verminderung der Resistenz von Generation zu Generation festgestellt werden, die anhand einer abgeschwächten Ausprägung einer Hypersensitive Response (HR) von ‘Riparia Gloire de Montpellier’ bis zur Akzession ‘Triomphe d’Alsace’ beobachtet werden konnte. Diese Hypothese deckt sich mit der Identifikation multipler schwacher QTLs für die Population CFxTA, die in den phänotypischen Infektionstests keine deutliche Aufspaltung hinsichtlich einer Resistenz gegen P. viticola zeigte.Due to adventive grapevine pathogens like Plasmopara viticola, variable problems in European viticulture such as yield loss and the high usage of plant protection still occur. For that reason many breeders invest hope in cultivating fungi-resistant varieties using American and Asian wild species as resistance donor in new crosses. Several resistance loci against P. viticola were identified from different working groups so far. By facing the possibility of P. viticola strains to overcome resistances, quantitative trait loci (QTL) analysis was used in this work to screen for new resistance loci in two cross populations. Hereby a major QTL (Rpv10.2) as well as several minor QTLs were detected. The calculation of the QTLs was based on phenotypic data obtained from infections tests and the creation of linkage maps of the cross populations ‘Tigvoasa’ x We 90-06-12 (TVxWe90) und ‘Cabernet Franc’ x ‘Triomphe d‘Alsace’ (CFxTA). Simple sequence repeat (SSR) and RNase H2-dependent amplicon sequencing (rhAmpSeq) markers were used to create the linkage maps. Rpv10.2 was identified as resistance locus by a major QTL on linkage group 09 in the genome of We90. The locus was introgressed by the resistant cultivar We 90-06-12, which derives from the Asian wild grape Vitis amurensis. The area of Rpv10.2 was restricted by the SSR-markers GF09-65 and GF09-47 to approximately 80 kb on the V. vinifera reference genome. This area matches the already identified Rpv10 locus from ‘Solaris’, which also derived from V. amurensis (Schwander et al. 2012). Based on microscopic observation of infected leaf samples, We 90-06-12 and ‘Solaris’ showed similar reaction of resistance to inhibit the growth of P. viticola hyphae. The putative candidate gene RPS5-like is suspected to stay in connections with the Rpv10-mediated resistance ‘Solaris’ (Zyprian et al., in preparation). Due to sequence analysis, the corresponding gene could be verified in We 90-06-12 without any differences. In comparison, a further candidate gene AP2/ERF-like showed a variation in the coding sequence. The variation was observed outside the functional area of the AP2 protein domain. In addition marker analysis repeatedly showed deviating data for We 90-06-12 regarding GF09-46 and GF09-48, which are markers used in breeding since many years to identify new cultivars carrying the Rpv10 locus. The results of this work give evidence for an Rpv10 haplotype defined as Rpv10.2, which can be used for breeding. Rpv10.2 can be distinguished from the Rpv10 locus by the markers GF09-68, GF09-46 and GF09-48. The findings of this work can be used for further characterization of the Rpv10.2 locus in the future. In case of population CFxTA multiple weak QTLs were detected. Those QTLs could only be reproduced for linkage group 12 and 17. The areas of the QTLs on those groups cover long distances on the V. vinifera reference genome. It is necessary to obtain additional marker data to point out if these QTLs are suitable for breeding. It should be mentioned that until now no resistance loci were detected on linkage group 17. In comparison, Rpv6 was detected on linkage group 12 (Marguerit et al. 2009). ‘Riparia Gloire de Montpellier’, a selection of the American wild grape Vitis riparia, was recognized as the origin of this locus. The variety ‘Triomphe d’Alsace’, which represents the resistance donor in case of the cross CFxTA, originates from ‘Riparia Gloire de Montpellier’. If the detected QTL on linkage group 12 is identical to the Rpv6 locus should be verified by further investigations. This work indicates that the resistance level decreases from ‘Riparia Gloire de Montpellier’ to ‘Triomphe d’Alsace’. The hypersensitive response (HR) shown by the cultivar ‘Triomphe d’Alsace’ is weaker compared to ‘Riparia Gloire de Montpellier’ and matches with the identification of multiple weak QTLs in the population CFxTA