Deciphering context-dependent amber suppression efficiency in mammalian cells with an expanded genetic code

The genetic code of organisms can be expanded by introducing orthogonal translation systems (OTSs). One of the most commonly applied OTSs in mammalian cells is the archaeal pyrrolysyl-tRNA synthetase/tRNA_Pyl_CUA (PylRS/PylT) pair from Methanosarcina species. Thereby, usually in-frame amber stop codons (UAG) are suppressed to site-specifically incorporate non-canonical amino acids (ncAAs) into target proteins. These ncAAs can harbor unique chemical moieties, allowing to probe or engineer protein structure and function with high precision. To date, applicability of an expanded genetic code has been particularly advanced in bacteria by optimizing OTS components, modifying host translation, and developing mutually orthogonal translation systems. In mammalian cells, development of genetic code expansion tools has been largely focused on intrinsic properties of the OTS itself, for instance by engineering OTS components or tuning their expression levels. However, several-fold differences in ncAA incorporation efficiency are frequently observed between different amber stop codon positions within a target protein. These unpredictable variations in incorporation efficiencies substantially hamper the theoretical advantage of ncAAs to modify any user-defined site within a target protein. Here, applying a proteomics-based approach and fluorescent reporter system, we compute and validate a linear regression model that predicts ncAA incorporation efficiency in mammalian cells based on the nucleotide context. Thereby, we demonstrate that the immediate context directly modulates the competition between ncAA incorporation and termination at UAG. Moreover, our data support a molecular model in which the identity of up- and downstream nucleotides influences translational efficiency independent of amino acid and tRNA identity. Instead, base stacking of neighboring nucleotides might uniquely affect codon-anticodon base pairing during decoding of UAG. Additionally, context-specific ribosomal pausing and speed could contribute to varying ncAA incorporation efficiency. Furthermore, treatment with aminoglycosides and inhibition of nonsense mediated decay are proposed to improve yields of ncAA-modified proteins in mammalian cells. Taken together, our strategy not only facilitates the applicability of an expanded genetic code in mammalian cells, but should also prove useful in further deciphering the molecular mechanisms that govern context effects in translational efficiency. A better general understanding of context effects in translation would in turn benefit synthetic expansion of the genetic code.Der genetische Code von Organismen kann durch die Einbringung orthogonaler Translationssysteme (OTSe) erweitert werden. Das Pyrrolysyl-tRNA Synthetase/tRNA_Pyl_CUA (PylRS/PylT) Paar der Spezies Methanosarcina ist eines der am häufigsten angewendeten OTSe in Säugerzellen. Üblicherweise wird damit das amber Stoppcodon (UAG) innerhalb eines Leserasters supprimiert, um an spezifischen Stellen eines Zielproteins nicht-kanonische Aminosäuren (nkASn) einzubauen. Diese nkASn können einzigartige chemische Motive enthalten, die es ermöglichen die Struktur und Funktion von Proteinen mit hoher Präzision zu untersuchen und zu manipulieren. Bisher wurde insbesondere in Bakterien die Anwendbarkeit eines erweiterten genetischen Codes verbessert, indem OTS Komponenten optimiert, die Translation in Wirtsorganismen modifiziert und wechselseitig orthogonale Translationssysteme entwickelt wurden. Die Weiterentwicklung von Methoden, um den genetischen Code in Säugerzellen zu erweitern, fokussierte sich überwiegend auf intrinsische Eigenschaften der OTSe selbst, zum Beispiel der Modifizierung von OTS Komponenten oder der Anpassung ihrer Expressionslevel. Häufig unterscheiden sich jedoch verschiedene UAG Positionen in ihrer Effizienz eine nkAS einzubauen in mehrfacher Höhe. Diese unvorhersehbaren Schwankungen in der Einbaueffizienz schränken den Vorteil von nkASn erheblich ein, theoretisch jede benutzerdefinierte Position innerhalb eines Zielproteins modifizieren zu können. In dieser Publikation berechnen und validieren wir mit Hilfe einer proteomischen Methode und eines fluoreszierenden Reportersystems ein lineares Regressionsmodell, das anhand des Nukleotidkontextes die Effizienz des nkAS Einbaus in Säugerzellen vorhersagt. Wir zeigen dadurch, dass der unmittelbare Kontext direkt das Verhältnis zwischen nkAS Einbau und Termination an UAG moduliert. Unsere Daten unterstützen zudem ein molekulares Modell, in dem die Identität der vorherigen und nachfolgenden Nukleotide die Effizienz der Translation unabhängig von der Identität der Aminosäure und tRNA beeinflusst. Hingegen könnte sich ein Basen-Stacking über benachbarte Nukleotide in einzigartiger Weise auf die Codon-Anticodon Basenpaarung während der Dekodierung von UAG auswirken. Zusätzlich könnten ein Pausieren sowie die Geschwindigkeit des Ribosoms in Abhängigkeit vom Kontext zu der uneinheitlichen Effizienz des nkAS Einbaus beitragen. Des Weiteren werden ein Behandlungsverfahren mit Aminoglycosiden und eine Inhibierung des Nonsense-mediated Decay vorgeschlagen, um die Ausbeute an nkAS-modifizierten Proteinen zu verbessern. Zusammenfassend vereinfacht unsere Strategie nicht nur die Anwendbarkeit eines erweiterten genetischen Codes in Säugerzellen, sondern sollte sich auch als nützlich erweisen, um die molekularen Mechanismen, über die der Kontext die Translationseffizienz beeinflusst, weiter zu entschlüsseln. Ein besseres allgemeines Verständnis der Kontexteffekte bei der Translation würde wiederum die synthetische Erweiterung des genetischen Codes fördern