Comparación de la actividad terapéutica in vitro de vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales obtenidas mediante dos técnicas de aislamiento

[ES] El beneficio de las terapias avanzadas basadas en las células mesenquimales estromales (MSC) viene dado principalmente por su potente efecto paracrino. A través de componentes secretados y liberados al medio extracelular, las MSC dirigen diversos procesos como la estimulación de la angiogénesis, la proliferación celular, la inmunomodulación hacia un fenotipo menos inflamatorio, disminución de la apoptosis celular, estimulación del cierre de herida y disminución de la fibrosis. Entre los elementos con capacidad paracrina secretados por las MSC se encuentran las vesículas extracelulares (EVs). Las EVs son partículas liberadas por las células que pueden contener en su interior diversos tipos de moléculas y de miRNAs capaces de modular la actividad de las células circundantes. Las EVs derivadas de las MSC (EVs-MSC) presentan las mismas capacidades terapéuticas que las células de las que derivan. Diferentes estudios han mostrado su eficacia como agentes inmunomoduladores, estimuladores de la proliferación celular y de la angiogénesis. Por este motivo las investigaciones actuales se están centrando en el uso de las EVs como agentes terapéuticos evitancdo de esta forma los principales inconvenientes que ha demostrado la terapia con células. En los múltiples ensayos preclínicos y clínicos realizados hasta el momento en los cuales se propone el uso de MSC o de EVs como posible tratamiento, se han observado resultados inconsistentes asociados a la falta de estandarización de los protocolos, entre ellos el uso de diferentes técnicas de aislamiento y purificación. El método más utilizado para el aislamiento de EVs está basado en ultracentrifugaciones seriadas (UC). Sin embargo, es una técnica en la que la cantidad de EVs obtenidas es relativamente baja, lo que supone un problema para su traslación tanto a modelos animales superiores como a la clínica. Es necesario establecer técnicas que permitan el escalado, la reproducibilidad y el cumplimiento de buenas prácticas de fabricación (GMP, del inglés Good Manufacturing Practices) en la extracción de las EVs. Para mejora el rendimiento de la extracción de EVs, se han puesto a punto diferentes protocolos de aislamiento entre ellos la filtración de flujo tangencial seguida de cromatografía de exclusión por tamaño (TFF-SEC). El objetivo de este trabajo es comparar el potencial terapéutico de las EVs aisladas mediante TFF-SEC y UC. Para ello, se han aislado EVs de MSCs de pulpa dentaria mediante las dos técnicas mencionadas anteriormente y se ha testado su capacidad regeneradora, inmunomoduladora y angiogénica mediante diferentes ensayos in vitro. De esta forma se pretende proponer una técnica que permita optimizar la extracción de EVs sin que se vea afectado su potencial terapéutico[EN] The benefit of mesenchymal stromal cells (MSC) advanced therapies is due mainly to their paracrine effect. Through the release of secreted components, including the extracellular vesicles (EVs), to the extracellular medium, MSC leads various processes, including angiogenesis, cellular proliferation, immunomodulation, apoptosis decrease, wound healing stimulation, and fibrosis decrease. EVs are particles released by the cells which contain several molecules with cellular activity modulation capacities. EVs from MSC (EVs-MSC) have the same therapeutic capacities as the cells themselves. Thus current investigation aims are the use of EVs-MSC as therapeutic agents avoiding this way the main disadvantages of cellular therapy. There are several EVs isolation techniques and that brings as a consequence inconsistency in the results. Differential ultracentrifugation (UC) is the most used technique but the quantities of EVs required for the superior animal's models pre-clinical and clinical translation can't be obtained with UC. For this reason, is necessary the proposal of new techniques allowing the isolation of the quantities of EVs needed in a scalable way, fulfill the good manufacturing practices (GMP) and preserve their biological activities. One possible option for this is a mixed technique including tangential flow filtration and size exclusion chromatography (TFF-SEC). Thus this work aims is to compare the therapeutic potential of the EVs-MSC isolated with TFF-SEC and the UC technique. Hence we tested the regenerative, immunomodulatory, and angiogenic capacities of the EVs-MSC isolated from conditioned medium of MSC dental pulp cultures using both techniques before mentioned through multiple in vitro assays.Selvitella Luna, SE. (2021). Comparación de la actividad terapéutica in vitro de vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales obtenidas mediante dos técnicas de aislamiento. Universitat Politècnica de València. http://hdl.handle.net/10251/17394