Thymic environment and thymopoiesis characterization in physiological conditions and in the context of therapeutic strategies by direct targeting of the thymus

Les immunodéficiences génétiques sévères (SCID) sont un groupe hétérogène de maladies monogéniques rares caractérisées par l’absence ou la non-fonctionnalité des cellules T. Leur traitement est basé sur la transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques ou autologues génétiquement modifiées injectées par voie intraveineuse. Bien qu’efficaces, ces traitements présentent des limites notamment la disponibilité en donneur compatible et le temps nécessaire à la reconstitution d’un compartiment de cellules T divers. Dans ce contexte, mon laboratoire d’accueil a développé une stratégie thérapeutique basée sur le ciblage du thymus. Ils ont ainsi montré que l’injection intrathymique (IT) de vecteurs viraux ou de progéniteurs hématopoïétiques permet d’obtenir une reconstitution du compartiment T.Au cours de ma thèse, je me suis intéressée à la caractérisation et la compréhension des mécanismes régulant l’environnement thymique et le développement T dans des modèles murins WT et SCID et à son rôle dans l’efficacité des approches de thérapie génique et cellulaire par injection IT.Le thymus, grâce à son architecture unique divisée en 2 zones distinctes, le cortex et la médulla, est essentiel au développement d’un compartiment de cellules T matures restreint aux molécules du CMH et tolérant au soi. Afin de mieux caractériser cet environnement thymique, j’ai participé, en collaboration avec les groupes de I. Amit et J. Abramson, à la cartographie de novo du compartiment épithélial thymique. Cette étude a permis la découverte d’une nouvelle population de cellules TEC médullaires, les cellules Tuft thymiques dont le rôle serait associé à la régulation de la réponse de type 2.Nous avons ensuite caractérisé les besoins métaboliques des thymocytes. Nous avons constaté que les transporteurs de phosphate inorganique PiT1 et PiT2 présentent des profils d'expression distincts dans les thymocytes murins et humains. Notamment, l'expression de PiT2, qui distingue les thymocytes à forte activité métabolique, n'est pas augmentée sur les thymocytes déficients en RAG2 ; immunodéficience caractérisée par un blocage avant le réarrangement du TCR. De plus, la régulation de l'expression de PiT1 est associée au vieillissement thymique. Ainsi, l'expression des transporteurs métaboliques peut être utilisée pour identifier des sous-ensembles de thymocytes qui sont altérés dans des conditions pathologiques et pourraient potentiellement être modulés pour optimiser la thymopoïèse.En parallèle de ces études, j’ai poursuivi le développement des approches thérapeutiques IT en m’intéressant au rôle de l’environnement thymique dans ces contextes. Tout d’abord, j’ai évalué le potentiel des vecteurs viraux adéno-associé (AAV) pour le traitement des SCID. Nous avons ainsi montré que l'injection d’AAV8-ZAP70 dans le thymus de souris immunodéficientes ZAP70-/- permet une transduction et une différenciation rapide des thymocytes, associée à la restauration de l’architecture thymique. Les cellules T fonctionnelles persistent à long terme en périphérie soulignant le potentiel thérapeutique des AAV pour le traitement des SCID.Par ailleurs, je me suis intéressée à la caractérisation de la prise de greffe et des premières étapes de différenciation après l’injection IT de progéniteurs hématopoïétiques avec un intérêt particulier pour la restauration de l’architecture thymique et le développement des cellules T régulatrices. J’ai ainsi pu montrer que les progéniteurs injectés ont une capacité d’expansion importante (>100x à 3 semaines) associée à leur différenciation en cellules T matures. Nous avons également observé une reconstitution rapide de la médulla corrélée avec la présence de cellules LTi issues des progéniteurs injectés et le développement de cellules T régulatrices.En conclusion, mes résultats montrent le potentiel thérapeutique de la stratégie IT pour le traitement d’immunodéficiences permettant d’obtenir une reconstitution thymique optimale.Severe combined immunodeficiencies (SCID) are rare monogenic diseases characterized by the absence or non-functionality of T lymphocytes. The treatment of these diseases is based on the intravenous administration of allogeneic or genetically-modified autologous hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC). Although effective, these cell and gene therapies are still associated with complications. Limitations are notably due to the availability of compatible donors as well as the reconstitution of a diverse T cell compartment without the complications of graft-versus-host disease. In this context, my host laboratory is developing an innovative therapeutic strategy based on the direct targeting of the thymus, the organ of T cell development. Their previous studies have shown that the intrathymic (IT) delivery of a therapeutic gene by lentiviral vector-mediated transfer or IT-administered healthy HSPC promotes reconstitution of the T cell compartment.During my PhD, I investigated the thymic environment in WT and SCID murine models as a function of the thymic epithelial compartment (TEC) and the metabolism of differentiating thymocytes. Furthermore, I evaluated the critical role of the epithelial environment in optimizing IT gene and cell therapy approaches aimed at correcting genetic immunodeficiencies.The architecture of a healthy thymus, made up of distinct cortical and medullary zones, is critical for the generation of mature T lymphocytes whose T cell receptors exhibit tolerance to self-antigens and are restricted to MHC-presented foreign antigens. To better characterize this thymic environment, we participated to the de novo mapping of the thymic epithelial compartment by scRNAseq analysis, in collaboration with the group of J. Abramson. This study led to the discovery of a new population of medullary TEC cells, thymic Tuft cells, which we postulate to be involved in the regulation of the type 2 immune response.I then evaluated the metabolic requirements of differentiating thymocytes as a function of their metabolite transporter expression. We found that the PiT1 and PiT2 inorganic phosphate transporters exhibit distinct expression profiles in murine as well as human thymocytes. Notably, PiT2 expression, distinguishing thymocytes with high metabolic activity, was not upregulated on immunodeficient RAG2-/- thymocytes, blocked prior to TCR rearrangement. Furthermore, upregulation of PiT1 expression was associated with thymic aging. Thus, metabolic transporter expression can be used to identify thymocyte subsets that are altered in pathological conditions and can potentially be modulated to optimize differentiation.In parallel to these studies, I determined the importance of the thymic environment in supporting novel IT gene and cell therapy strategies. Specifically, we found that an adeno-associated viral vector 8 (AAV8)-based delivery of ZAP70 directly into the thymus of ZAP70-/- immunodeficient mice was superior to a lentiviral-based strategy, allowing a rapid transduction and differentiation of gene-corrected T cells, as well as their long-term maintenance (>1 year). I determined that this effect was associated with the rapid restoration of the thymic architecture, within 10 days of gene transfer.Furthermore, I characterized the engraftment and early differentiation steps of IT-administered HSPC as well as their role in restoring the thymic architecture. I determined that IT-injected HSPC have an important expansion capacity (>100x within 3 weeks) and promote the rapid differentiation of regulatory T cells. Differentiation of the latter cells was associated with a rapid reconstitution of the medulla and the expansion of donor-derived lymphocyte tissue inducer cells (LTi), underlining the interplay between different cell types in thymocyte differentiation.Thus, my results highlight the therapeutic potential of a thymus targeting strategy for the treatment of immunodeficiencies