Caractérisation moléculaire et fonctionnelle du motif de liaison PDZ (PBM) de la protéine de polarité cellulaire planaire (PCP) VANGL2

VANGL2 est un composant central de la voie de polarité cellulaire planaire. VANGL2 a un rôle central au cours du développement embryonnaire. Des études récentes ont établi un lien entre l'expression de VANGL2 et la biologie du cancer. VANGL2 contiennent quatre domaines transmembranaires, un motif C-terminal de liaison aux domaines PDZ (PBM) et un PBM non-conventionnel plus interne. Durant mon travail de thèse, j'ai cherché à caractériser le réseau complexe d’interactions entre VANGL2 et certains membres de la famille des protéines à domaine PDZ. À cette fin, j'ai criblé une nouvelle version du PDZome humain (hPDZome V.2) par test Yeast Two-Hybrid (Y2H) et par Holdup en utilisant différents fragments C-terminaux de VANGL2 comme appâts. J’ai étudié la biochimie de ces interactions analysant plus en détails les caractéristiques de liaison de VANGL2 aux domaines PDZ en mesurant l'affinité de son PBM C-terminal pour divers domaines PDZ. Plus précisément, j'ai utilisé un test de polarisation de fluorescence combiné à une approche de type « peptide spot array » pour étudier la contribution de chaque résidu du PBM de VANGL2 dans l'interaction avec trois domaines PDZ: DLG1 PDZ1-2, SNX27 PDZ et SCRIB PDZ3. Et j’abordé l'importance fonctionnelle du PBM de VANGL2. En utilisant des mutants VANGL2 ∆ PBM exprimés ectopiquement ou de façon endogène grâce à des lignées de cellules épithéliales de souris altérée au niveau du PBM de VANGL2 par une approche CRISPR Cas9. Et aussi en réalisant les études sur la perte de fonction par ARN interférents (siRNA) des protéines à domaines PDZ DLG1, SCRIBBLE et SNX27. Enfin, j'ai pu confirmer l'interaction physique entre VANGL2 et SDC4.VANGL2 is a core component of the so-called planar cell polarity pathway. VANGL2 has a central role during embryonic development. Recent studies have established a link between VANGL2 expression and cancer biology. VANGL2 contain four transmembrane domains, a C-terminal interaction motif for PDZ domains and a non-conventional internal PDZ binding site. In the present work, I deciphered the complexity of the VANGL2-PDZ network by screening a new version of the human PDZome (hPDZome V.2) by Yeast Two-Hybrid (Y2H) and by holdup using different Vangl2 fragments as baits. I also studied the biochemistry of the interaction by measuring the affinity of its C-terminal PBM for various PDZ domains. More specifically, I used a fluorescence polarization assay combined with a spot array approach to investigate the contribution of each residue of the VANGL2 PBM to the interaction with three PDZ binders: DLG1-PDZ1-2, SNX27-PDZ and SCRIB PDZ3. I also addressed the functional importance of the conventional VANGL2 PBM by cytological studies conducted with ectopically expressed ∆ PBM Vangl2 constructs or with mouse epithelial cell lines disrupted for the PBM of Vangl2 by a CRISPR Cas9 approach and also using loss-of-function studies (siRNA) of the PDZ proteins DLG1, SCRIBBLE and SNX27. Finally, I could confirm the physical interaction between VANGL2 and one member of the Syndecan protein family, SDC4