Role of E6 isoforms on RNA metabolism from HPV related cancers

Les papillomavirus humains (HPV) sont des petits virus non enveloppés à ADN double brin infectant les épithéliums cutanés et muqueux. L'infection par un HPV à tropisme muqueux est l'infection sexuellement transmissible la plus prévalente chez l'espèce humaine. Si une infection par l'un des quelques 200 types d'HPV est le plus souvent asymptomatique, certains types infectant les muqueuses sont capables d'induire des cancers. Ces HPVhr (HPV à haut risque oncogénique) étaient responsable de 690000 cas de cancers en 2018 dans le monde. Le génotype HPV16 est responsable à lui seul de 65% de ces cancers. La capacité d'HPV16 à provoquer des cancers provient de plusieurs .carnctéristque.s.propr.e.s.auxlIPVhLL'expression.continue ... des ... oncoprotéines .. :v:irales .. E6. ... et.E2 .. fait progressivement perdre leur homéostasie aux cellules infectées, à travers l'induction de la dégradation de p53 et pRb notamment. Des centaines d'autres protéines cellulaires voient aussi leurs fonctions dérégulées par les deux oncoprotéines et entrainent la transformation du phénotype cellulaire. La régulation de l'expression des gènes viraux au niveau post-transcriptionnel participe à réguler l'expression des oncoprotéines principalement par épissage alternatif. Contrairement aux autres HPV, les HPVhr produisent un seul transcrit bicistronique E6E7 pour coder les deux oncoprotéines et c'est l'épissage de ce transcrit dans la région codant E6 qui régule leur expression. De manière intéressante, l'évènement d'épissage majoritaire aboutit à la formation d'un transcrit mature ne pouvant plus coder E6 mais ayant la capacité de produire une isoforme tronquée appelée E6*I. Cette caractéristique singulière partagée par les HPVhr pose la question de la place de l'épissage alternatif et de }'isoforme tronquée E6*I dans le processus de carcinogenèse. Cette place n'est que peu définie voir controversée dans la littérature. Les objectifs de ce travail de thèse ont donc été i) de mesurer l'impact de l'expression ectopique d'E6*I d'HPV16 sur le transcriptome cellulaire et, ii) d'étudier les mécanismes moléculaires expliquant les dérégulations induites par E6*I. L'impact de E6*I sur le transcriptome cellulaire a été mesuré par RNAseq et révèle que l'expression stable de E6*I dans le modèle HPV négatif U-2 OS aboutit à la dérégulation de l'expression de 53 gènes, là où l'expression stable de E6+E6*I dérégule l'expression de 419 gènes cellulaires. Etonnamment, seul 11 transcrits sont partagés par ces deux conditions. Les 53 transcrits dérégulés par E6*I codent des protéines intervenant notamment dans le métabolisme du stress oxydant et s'accompagne d'une augmentation du taux d'espèces réactives de l'oxygène au niveau phénotypique. L'absence de ces effets dans les U-2 OS exprimant E6+E6*I indique possiblement une relation dynamique entre les deux isoformes. Une partie de la controverse entourant le rôle de E6*I provient de sa détection impossible en condition physiologique. Nous avons montré ici pour la première fois que l'expression d'ARNm E6*I incapables d'être traduits n'entraine pas de stress oxydant, prouvant que la production de la protéine E6*I est indispensable à l'induction de ce stress. L'étude de la prise en charge du transcrit E6*I par la machinerie traductionnelle via la technique de polysome profiling n'a en revanche pas permis de définir si E6*I est efficacement traduite. Nous avons enfin montré que l'induction du stress oxydant se fait majoritairement par une activation des protéines de la famille des NADPH oxydases. Des études ultérieures seront nécessaires pour déterminer l'implication précise des différents membres de cette famille génératrice de ROS.Human papillomaviruses (HPV) are small non-enveloped double strand DNA viroses infecting cutaneous and mucosal epithelia. Infection by a mucosal type HPV is the most prevalent sexually transmitted infection within the human species. Infection by one of the 200 types ofHPV is in most cases asymptomatic, several mucosal types are capable of inducing cancers. These hrHPV (high risk oncogenic) were responsible for 690,000 cancer cases in 2018 worldwide. HPV16 genotype alone causes 65% ofthose cancers. HPV16 capacity to induce cancer corne from multiple characteristics unique to hrHPV. The continuous expression of viral oncoproteins E6 and E7 progressively drives the loss of homeostasis in infected cells, notably through the induction of p 53 and pRb degradation. Hundreds of other cellular proteins have their functions deregulated by E6 and E7 ultimately driving the cellular phenotype transformation. Viral gene expression regulation at post transcriptional level greatly regulates oncoproteins expression mainly through alternative splicing. Contrary to other HPV, hrHPVs produce a single bicistronic E6E7 transcript encoding both oncoproteins and its splicing in the E6 ORF regulates their expression. Interestingly, the major splicing event forms a mature transcript that cannot produce E6 but capable of producing a truncated isoform called E6*I. This unique capability shared by hrHPV s raises the question of the importance of this splicing event and truncated isoform in HPV driven carcinogenesis. E6*I roles are poorly defined or controversed in the literature. Therefore, the goals of this work were i) to measure the impact of E6*I from HPV16 on cellular transcriptome and, ii) to study the molecular mechanisms behind the deregulations induced by E6*I. E6*I impact on cellular transcriptome was measured by RNAseq and reveals that the stable expression of E6*I in the HPV negative U-2 OS model deregulates the expression of 53 genes where the stable expression ofboth E6 and E6*I deregulates the expression of 419 genes. Strikingly, only 11 shared genes are deregulated in both conditions. The 53 genes deregulated by E6*I notably encode proteins implicated in oxidative stress and go hand in hand with an increased level of reactive oxygen species at the phenotypic level. Lack ofthose effect in U-2 OS expressing both E6 and E6*I isoforms could indicate an interplay between the two. The controversy around E6*I roles in carcinogenesis corne in part from its impossible detection at protein level in physiological condition. We show here for the first time that the expression of E6*I transcript lacking translation initiation codon fails to induce oxidative stress, proving that E6*I protein production is necessary to induce it. However, the study of the management of E6*I transcripts by the translation machinery through the polysome profiling technique failed to clearly defined if those transcripts are efficiently translated. We finally demonstrated that E6*I oxidative stress induction mainly corne from the activation of the NAD PH oxidase protein family. Further study are needed to determine which members ofthis family generate ROS