Etude de la photodynamique de mutants de la protéine fluorescente photo-commutable rsEGFP2 en utilisant des spectroscopies optiques résolues dans temps

Les protéines fluorescentes photo-commutables réversibles (RSFP), qui peuvent être commutées de manière réversible entre un état fluorescent (forme On, cis) et un état non fluorescent (forme Off, trans), sont maintenant couramment utilisés dans les microscopies de fluorescence super-résolues. Leurs propriétés et caractéristiques photo-physiques (brillance, rendements quantiques de commutations et de fluorescence…) contrôlent les paramètres tels que la résolution et la vitesse d'acquisition de l'image. Cependant le mécanisme et la dynamique de commutation qui sont à l’origine de ces paramètres font toujours débat.Cette thèse porte sur l'élucidation de la photo-dynamique d'une RSFP négative, la protéine rsEGFP2. C’est une variante de la protéine fluorescente verte aqua victoria (avGFP) et une protéine couramment utilisée dans les techniques de microscopie de fluorescence super-résolue. Des études antérieures ont montré que le processus de commutation Off vers On est un processus séquentiel d’isomérisation trans-cis du chromophore à l’état excité suivi d’un transfert de proton à l’état fondamental. De plus un chromophore « twisté » se forme à l'échelle de temps de la picoseconde avec une dynamique contrainte par la proximité de la valine 151. La mutation de cette dernière en alanine (V151A) et leucine (V151L) conduit à l’existence de deux conformères différents pour les formes Off. Au cours de la thèse nous avons utilisé la spectroscopie d'absorption transitoire électronique et vibrationnelle de la femtoseconde jusqu’à la minute pour l’étude de la protéine sauvage, V151A et V151L. Nos résultats, combinés à ceux obtenus par cristallographie par nos collaborateurs, ont permis de construire un mécanisme de photo-commutation Off vers On pour ces trois protéines. Plus particulièrement il a été montré que le rendement quantique de photo-commutation Off vers On est similaire, 11, 12 et 14% pour WT, V151L et V151A. Cette faible différence pour des formes off différentes a été rationalisées par l’existence d’un mécanisme d’isomérisation identique de type « hula-twist » avec un temps caractéristique sub-picoseconde suivie d’un réarrangement structural microseconde de la protéine à l’état fondamental et d’une déprotonation milliseconde. La dynamique de commutation On vers Off a été aussi étudiée pour 23 variants de la protéine rsEGP2. Les résultats montrent que les rendements quantiques de fluorescence et de commutation sont contrôlés par l'existence d'au moins deux états dans l’état fondamental qui sont caractérisés par des temps de vie de fluorescence très différents (150 ps et 2,3 ns). Les résultats de cette thèse devraient non seulement contribuer à la compréhension de la photo-dynamique des RSFP mais aussi permettre de concevoir de nouvelles protéines optimisées pour la bio-imagerie.Reversible photo-switchable fluorescent proteins (RSFP) are FP that can be reversibly toggled back and forward between a fluorescent on-state and a non-fluorescent off-state and thus allow to achieve super-resolution in fluorescence microscopy (e.g., in reversible saturable optical fluorescence transition – RESOLFT – microscopy). Even though their photo-physical parameters (switching and fluorescence quantum yield…) are linked to the image resolution and the image acquisition speed, the switching mechanism that controls these parameters is still a matter of debate.This thesis is focused on elucidating the photo-dynamics of rsEGFP2, a negative RSFP variant of the aqua victoria green fluorescent protein (avGFP). The rsEGFP2 is currently the reference fluorescent marker in RESOLFT microscopy. The off to on switching involves a trans-to-cis isomerization and a proton transfer. It was previously highlighted that isomerization dynamics is characterized by a twisted chromophore which is formed at the picosecond time scale and restricted by the close proximity to the Valine 151. The mutation of Valine 151 into alanine (V151A) and leucine (V151L) showed that two different off-conformers exist. Their origin is presumably from a hula-twist and a one-bond-flip on-to-off switching mechanism for V151L and V151A, respectively. In this thesis, we employed electronic and vibrational time-resolved absorption spectroscopy from the femtosecond to the minute time scales to study the photo-dynamics of wild-type rsEGPF2, V151A and V151L. They were combined with the results of time-resolved crystallography obtained by collaborative groups. These two approaches permitted to infer the photo-switching mechanism of rsEGFP2 and its variants. Off-to-on photo-switching quantum yields of 11, 12 and 14% were estimated for WT, V151L and V151A, respectively. Such small differences were rationalized hypothesizing a common trans-to-cis isomerization via a sub-picosecond hula-twist mechanism, followed by microsecond preceding a sub-millisecond-scale multi-step deprotonation. Besides, the thesis also coped with the on-to-off dynamics of 23 other variants of rsEGFP2. From this study, it resulted that fluorescence and switching yield are controlled by the existence of at least two different ground states exhibiting a difference in the fluorescence lifetime of one order of magnitude (150 ps vs 2.3 ns). Overall, the outcomes of these studies will not only contribute to a better understanding of the photo-physics of RSFPs but will also open newer perspectives towards the design of optimized RSFPs for advanced bio-imaging applications