Development of pH-dependent antibodies to improve the safety profile of cancer immunotherapies : the example of targeting the AXL receptor

Face à la difficulté d’identifier des antigènes spécifiques de tumeurs, les anticorps thérapeutiques actuels ciblent majoritairement des antigènes associés aux tumeurs, dont l’expression est augmentée à la surface des cellules cancéreuses. Cependant, le ciblage de l’antigène exprimé de manière basale par les tissus sains génère des toxicités, parfois sévères, pour les patients. C’est pourquoi, des nouvelles stratégies s’appuient sur des particularités intrinsèques du microenvironnement tumoral pour optimiser la spécificité de ciblage tumorale des anticorps. Nous avons décidé de tirer profit du phénomène d’acidification du microenvironnement tumoral, liée l’hypoxie tumorale et au métabolisme particulier des cellules tumorales en prolifération (effet de Warburg), pour développer des anticorps pH-dépendants, pouvant se lier à une cible au pH acide de l’environnement tumoral tout en n’ayant une très faible fixation sur la même cible à pH physiologique. Si l’ingénierie de tels anticorps par mutagène dirigée a déjà été démontrée, cette approche est chronophage, fastidieuse et spécifique d’une cible donnée.En premier lieu, le projet a consisté à valider les outils et à développer une méthode de sélection de fragments d’anticorps (scFvs) en condition acide par phage display afin de favoriser l’identification d’anticorps se liant à une cible d’intérêt dans des conditions mimant le microenvironnement tumoral. Comme preuve de concept, nous avons effectué ce processus de sélection avec des banques synthétiques naïves de scFvs sur une cible modèle, le récepteur à activité tyrosine kinase AXL, surexprimé dans de nombreux cancers, pour lequel des outils ont été générés au préalable au laboratoire. A l’issue de cette sélection, un criblage ELISA différentiel à deux pH a permis d’isoler plusieurs scFvs se liant préférentiellement au récepteur AXL à pH acide mais avec une fixation réduite à pH physiologique. Deux méthodes in vitro différentes par ELISA et Résonance Plasmonique de Surface, dont le mode de détection est indépendant du pH, ont permis de confirmer les propriétés de liaison pH-dépendante de la plupart des anticorps au format IgG au récepteur AXL. Les deux anticorps sélectionnés pour leur faible liaison au pH physiologique in vitro montrent également une liaison pH-dépendante à la cible exprimée par les cellules tumorales. Mais surtout, ces anticorps possèdent une très faible fixation à pH physiologique à la cible exprimée à la surface de myoblastes humains immortalisés, mimant du tissu sain. Il a été confirmé que ces anticorps ont la capacité d’internaliser le récepteur AXL de lignées cancéreuses, constituant un atout majeur pour le développement futur d’anticorps armés de drogues cytotoxiques avec un meilleur profil de tolérance. Afin de démontrer le potentiel des anticorps pH-dépendants dans la réduction de la toxicité par ciblage du tissu sain, nous avons développé un modèle d’étude in vivo de la biodistribution d’anticorps par imagerie chez des souris greffées simultanément avec une lignée tumorale et des myoblastes humains.Devant la robustesse du processus d’identification d’anticorps pH-dépendants dirigés contre le récepteur AXL, nous avons voulu élucider le mécanisme responsable de cette spécificité d’interaction. Des études de liaison des anticorps sur différents domaines et mutants du récepteur AXL ont alors été menées afin de préciser l’épitope de ces anticorps. Ces études ont notamment mis en évidence que certaines histidines présentes au niveau de l’antigène sont critiques à la bonne fixation de ces anticorps. L’histidine étant le principal résidu dont l’état de protonation est susceptible d’être modulé au sein du microenvironnement tumorale, il est probable que ce résidu présent au sein de l’antigène contribue au mécanisme d’interaction pH-dépendante de ces anticorps.Given the difficulty of identifying tumor-specific antigens, antibody-based immunotherapy mostly targets tumor-associated antigens overexpressed in cancer cells. However, targeting antigen weakly expressed in healthy tissues results in unwanted side effects, sometimes severe, for patients. Therefore, new strategies are based on intrinsic features of the tumor microenvironment to optimize the tumor targeting specificity of antibodies. We decided to take advantage of the tumor microenvironment acidification, linked to tumor hypoxia and the particular metabolism of proliferating tumor cells (Warburg effect) to develop pH-dependent antibodies. This kind of antibody can bind to a specific target at the acidic pH of the tumor environment and have a very low binding to the same target at physiological pH. While the engineering of such antibodies has already been demonstrated by rational mutagenesis, this approach is laborious, time-consuming and target-specific.First, the project consisted in validating the tools and developing a method for the selection of antibody fragments (scFvs) under acidic conditions by phage display. The aim was to identify antibodies capable of binding to a target under conditions mimicking the tumor microenvironment. As a proof of concept, we performed this selection process with synthetic naive scFvs libraries on a model target, the AXL receptor tyrosine kinase. Tools had been previously generated in the laboratory for this receptor, which is overexpressed in many cancers. Following this selection, a differential ELISA screening at two pH led to the identification of several scFvs capable of binding to AXL at acidic pH but with reduced binding at physiological pH. Two different in vitro methods (ELISA and Surface Plasmon Resonance), whose detection modes are pH- independent, validated the pH-dependent binding properties of most IgG antibodies to the AXL receptor. Two antibodies were selected for their low binding at physiological pH in vitro. Both antibodies also demonstrated pH-dependent binding to the target expressed in tumor cells. Most importantly, these antibodies had very low binding at physiological pH to the target expressed on the surface of immortalized human myoblasts, mimicking healthy tissue. The induction of AXL receptor internalization by both antibodies has been confirmed which is a major asset for the development of antibody-drug conjugates with a better safety profile. In order to demonstrate the potential of pH-dependent antibodies in reducing toxicity due to the healthy tissue targeting, we developed an in vivo model to study antibodies biodistribution by imaging in mice that were simultaneously grafted with a tumor cell line and human myoblasts.Given the robustness of the identification of pH-dependent antibodies directed against the AXL receptor, we wanted to elucidate the mechanism underlying this interaction specificity. Binding studies of antibodies on different domains and mutants of the receptor were then carried out in order to specify the epitopes of these antibodies. Mutagenesis studies performed on the antigen showed that these antibodies bound mainly to two histidine residues of the antigen. Histidine being the main residue whose protonation state is likely to be modulated in the acidic tumor microenvironment, it is therefore very likely that it contributes to the mechanism of pH-dependent interaction with antibodies