Study of starch-bound protein’s stoichiometry : toward new programs for the selection and the production of new potato’s varieties

La pomme de terre représente, en termes de quantité produite, la 5ème culture agricole, et la 4ème source d’amidon dans le monde. De plus, son marché est en pleine expansion parce qu'elle possède le plus haut rendement d'amidon produit par parcelle de terre. L’amidon est aujourd’hui la source principale de carbohydrates dans la nourriture humaine et du bétail. Il est aussi utilisé comme additif alimentaire, colle, bioplastique et biocarburant. Il s’agit d’un polymère de glucose lié en α-1,4 avec quelques points de branchements en α-1,6. Les recherches en matière de compréhension des protéines responsables de la synthèse et de la dégradation de l’amidon ont permis de mieux appréhender son métabolisme. Toutefois, les mécanismes d’association de ces protéines à l’amidon sont encore aujourd’hui mal compris. D’un point de vue fondamental, les objectifs de ma thèse étaient de mieux comprendre cette association entre le grain d’amidon et ces protéines. À l’aide d’analyses par spectrométrie de masse, nous avons, dans un premier temps, identifié l’ensemble des protéines liées à l’amidon de pomme de terre. Nous avons ensuite établi leur stœchiométrie par protéomique quantitative. Puis, nous avons comparé cette stœchiométrie entre différentes formes de grains et mis en évidence que cette stœchiométrie fluctuait en fonction de la taille des grains. Par la suite, nous avons étudié l’incorporation d’azote lourd 15N dans les séquences des protéines liées à l’amidon à différents temps de la tubérisation pour suivre de manière dynamique l’association des protéines au grain d’amidon durant la synthèse du tubercule. Ces résultats ont montré une plus forte incorporation de l’azote durant les 3 premières semaines de la tubérisation et une différence marquée de ce taux d’incorporation entre les amidons synthases, responsables de l’élongation des chaines de glucanes de l’amidon, et les enzymes de branchement, responsables de la formation des points de branchements. Nous avons aussi étudié l’impact que pouvait avoir la protéine majoritaire du grain, la Granule-Bound Starch Synthase (GBSS), sur l’association des autres protéines au grain par l’analyse protéomique comparative des protéines liées au grain d’amidon de pommes de terre mutantes pour cette protéine. Enfin, nous avons miniaturisé les protocoles jusqu'à l’analyse d’un grain unique, évitant ainsi les biais amenés par l’hétérogénéité des grains à l’intérieur d’un même échantillon. Les avancées techniques de ce projet permettront, au travers de la collaboration de mon laboratoire d’accueil et de l’entreprise Florimond Desprez Veuve et Fils, d’identifier de nouveaux marqueurs de sélection pour contribuer au développement de programmes novateurs pour la sélection et la production de nouvelles variétés de pommes de terre.Potato represents, in term of quantity produced, the 5th crop culture, and the 4th starch source in the world. Moreover, its market is booming, as a result of its highest starch/land parcel yield. Starch is nowadays the main source of carbohydrate in human and cattle food. It is also used as food additive, glue, bioplastic and biofuel. Researches that have been leaded in order to understand the functions of proteins responsible of starch synthesis and degradation allowed to understand better its metabolism. Nevertheless, the mechanisms of association between the granule and the proteins are still misunderstood. In a fundamental point of view, the objective is to better understand these association mechanisms. With the help of mass spectrometry, we first identified the whole proteome of potato starch. Then, established stoichiometry of proteins bound to potato starch by quantitative proteomics. Afterward, we have compared this stoichiometry between different granules morphologies, and have highlighted that protein stoichiometry inside the granule fluctuates with its size. Thereafter, we have studied the incorporation rate of exogen heavy nitrogen 15N in the sequence of starch bound proteins at different time, in order to follow dynamically the association of proteins to the granule. These results demonstrated a higher incorporation rate during the first three weeks of the tuberization, and a difference of incorporation between the starch synthases, which elongate the glucan chains, and the starch branching enzymes, which form the branching points. Moreover, we have investigated the impact of the major protein inside the starch granule, the Granule Bound Starch Synthase (GBSS), on the association of the other proteins by comparative proteomics between starch granules from mutant potatoes for this protein. Finally, protocols will be miniaturized up to the analysis of a single starch granules, to avoid bias due to inter-granule heterogeneity. In a research and development point of view, the collaboration with the breeding company Florimond Desprez Veuve et Fils will allow the development of programs of selection and production of new potato varieties, particularly by the identification of protein markers for a given phenotype