Development of a new bioanalytical technique based on surface plasmon resonance imaging for the on-line monitoring of influenza viruses influenza viruses in vaccine bioprocesses

Les épidémies saisonnières du virus de la grippe, associées à la menace constante d'une nouvelle pandémie, incitent les fabricants de vaccins à développer des procédés plus réactifs que le procédé traditionnel basé sur l’ovoculture. Bien que les procédés alternatifs développés, basés sur la culture cellulaire, offrent de nombreux avantages ils nécessitent encre des optimisations afin de pouvoir concurrencer sérieusement le processus traditionnel. Ainsi, les autorités régulatrices incitent les fabricants de vaccins à développer des outils analytiques en-ligne pour surveiller à la fois les paramètres critiques du procédé (CPP) et les attributs de qualité critiques (CQA) des produits dans les bioprocédés dans le cadre de la démarche Process Analytical Technology. Aujourd'hui, la technique de référence pour le dosage d’activité vaccinale est l’immunodiffusion radiale (SRID). Elle nécessite une production annuelle de réactifs potentiellement critique pour la libération des lots et ne peut pas être mis en œuvre pour du suivi de procédé. Les techniques de quantification physique (TRPS, virométrie, NTA…) récentes apparaissent plus appropriées que les dosages d'infectivité traditionnels pour du suivi en-ligne étant donné le ratio entre les particules virales totales et infectieuse de 10-10000. Cependant, ces techniques ne fournissent pas d’information concernant l’activité vaccinale. Au cours de cette thèse a été développé un test analytique pour la quantification de l'hémagglutinine (HA) et de virus bioactifs basé sur l'imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi). La méthode est basée sur la capture par affinité de HA par les glycanes possédant une extrémité terminale de type acide sialique. Les conditions ont été optimisées pour offrir une régénération de la surface afin d'effectuer des analyses séquentielles. Des échantillons de vaccins et de virus produits sur diverses plateformes/substrats de culture cellulaire ont été analysés sur le capteur dans le but d’évaluer les cinétiques de production virale. Ce test permet une évaluation rapide (<10 mins) de l’activité de l'hémagglutinine grippale avec une gamme analytique large (30 ng HA.mL-1-20 μg HA.mL-1). De plus, la technique offre une limite de détection (LOD) 100 fois inférieure à SRID, ainsi qu'une meilleure reproductibilité que la SRID et ses alternatives potentielles (<5% RSD vs 6-15%). Un tel test a également permis d'atteindre une LOD <106 particules virales infectieuses.mL-1. L'applicabilité de ce test pour le suivi en-ligne des bioprocédés a été validée par l’évaluations de cinétiques de production virales, offrant bonne corrélation avec la concentration en particules virales totales et la quantité totale en protéines HA dans deux lignées cellulaires de production. Nous avons également validé que ce test permettait une évaluation de l’activité pour du virus entier. Enfin, nous avons conçu et évalué une ligne d'échantillonnage et de purification automatisée pour l’évaluation en-ligne de la cinétique de production virale dans une culture cellulaire aviaire en suspension. Ce travail de thèse a ainsi permis de fournir un outil innovant pour le développement de nouveaux bioprocédés vaccinaux (suivi en-ligne, formulation, études de stabilité), soutenant l'initiative PATInfluenza virus seasonal epidemics, associated with the constant threat of new pandemic outbreak, challenge vaccine manufacturers to develop responsive processes that can outreach the limitations of traditional egg-based technology. However, while cell culture allows for more versatility regarding process development and monitoring, these alternatives still require optimization to seriously concurrence the traditional process. FDA’s Process analytical Technology (PAT) and Quality by Design (QbD) guidances impels vaccine manufacturers to implement on-line technologies to monitor both critical process parameters (CPP) and the bioproduct’s critical quality attributes (CQA) within bioprocesses. Today, Influenza vaccine potency is evaluated by single-radial immunodiffusion (SRID), which requires the annual production of strain-specific reagents that constitutes a potential bottleneck for the release of vaccine lots and cannot be implemented for in-process monitoring. On the other hand, while recent physical quantification techniques appear more relevant than traditional infectivity assays for influenza virus monitoring as the ratio of total to infectious influenza virus vary from 10-1000, they are not potency-indicating. During this thesis, we developed and evaluated a potency-indicating assay for rapid and label-free quantification of influenza hemagglutinin (HA) antigens and whole influenza viruses based on quantitative surface plasmon resonance imaging (SPRi). The method is based on affinity capture of hemagglutinin antigen by sialic-acid terminated glycans. Conditions were optimized for the regeneration of the surface, in order to run multiple sequential analyses. Influenza vaccine and virus samples derived from various cell culture platforms were processed onto the sensor to evaluate viral production kinetics. This assay offers a quantification of influenza hemagglutinin within minutes with a wide dynamic range (30 ng HA/mL-20 μg HA/mL). Also, the technique provides a limit of detection (LOD) 100 times lower than SRID, as well as a better reproducibility than SRID and its potential alternatives (<5% RSD vs 6-15%). Such a test also allowed to achieve a LOD