Biogenesis analysis and characterization of recombinant extracellular vesicles for biomedical applications

Les vésicules extracellulaires sont des vésicules produites par les cellules, entourées d’une bicouche lipidique et renfermant des protéines et des acides nucléiques ayant un rôle dans la communication entre cellules. La biogénèse de ces vésicules se fait selon deux voies principales. Les exosomes se forment dans les endosomes multivésiculaires tandis que les microvésicules bourgeonnent directement à la membrane plasmique des cellules. Les deux voies mettent en jeu des mécanismes cellulaires diverses et utilisent certaines protéines spécifiques parfois également utilisées par les rétrovirus pour sortir de leur cellule hôte. La capacité des vésicules extracellulaires à transporter des protéines et des acides nucléiques et à interagir avec des cellules cibles, expliquent le récent intérêt qui leur est porté pour des applications biomédicales. La société Ciloa (Ciloa SAS – Montpellier) a élaboré une stratégie permettant d’adresser une protéine d’intérêt dans les vésicules extracellulaires. Grâce à une séquence peptidique spécifique (appelée peptide pilote), des cellules en culture peuvent produire des vésicules extracellulaires recombinantes contenant une protéine d’intérêt. Des vésicules extracellulaires contenant la protéine d’intérêt CCR4 ont ainsi été produites et isolées selon un protocole établi par la société Ciloa. Les préparations de vésicules extracellulaires ainsi isolées ont ensuite été caractérisées par leur taille, leur morphologie et leur contenu protéique avec différentes méthodes. Les voies de biogénèse de ces vésicules extracellulaires dans les cellules productrices ont également été étudiées. Des expérience d’ELISA, western blot, d’immunocapture et de spectrométrie de masse ont ainsi permis de mettre en évidence la présence de protéines marqueurs des vésicules extracellulaires dans des vésicules contenant la protéine CCR4. Les différents instruments utilisés pour caractériser la taille et la morphologie des vésicules extracellulaires ont permis d’identifier la présence de particules sphériques de 30 à 120 nanomètres de diamètre environ.Extracellular vesicles are vesicles produced by cells, surrounded by a membrane bilayer and containing proteins and nucleic acids. They have a role in cell-cell communication. Biogenesis of extracellular vesicles occurs via two major pathways. Exosome are formed in multivesicular bodies whereas microvesicles bud directly at the plasma membrane. Various mechanisms have been described for these two pathways using specific proteins sometimes also used by some retrovirus for their egress from the host cell. Ability of extracellular vesicles to carry proteins and nucleic acids and to interact with target cells explains why they have a growing interest for biomedical applications. Ciloa society (Ciloa SAS – Montpellier) developed a strategy to target a protein of interest in extracellular vesicles. Cells in culture can produce recombinant extracellular vesicles containing a protein of interest thanks to a specific peptide sequence (named pilot peptide). Extracellular vesicles containing the protein of interest CCR4 have been produced and isolated according to a protocol established by Ciloa society. EVs preparations isolated in this way were then been characterized by size, morphology and their protein contents with different methods. Biogenesis of these extracellular vesicles in productive cells was also studied. ELISA assay, western blots, immunocapture and mass spectrometry experiments were performed to highlight the presence of extracellular vesicles protein markers in vesicles containing CCR4. Several instruments used to characterize size and morphology of extracellular vesicles revealed the presence of spherical particles with a diameter of around 30 to 120 nanometers