An Investigation into the Phenotypic Switching of Dermal Fibroblasts into Cancer-Associated Fibroblasts in the Melanoma Tumour Microenvironment

Aux stades avancés, le mélanome est le cancer de la peau le plus agressif en raison de son fort potentiel métastatique et sa résistance aux traitements. Malgré les progrès récents réalisés dans sa prise en charge, environ 50 % des patients atteints de mélanome avancé sont en impasse thérapeutique. Une stratégie prometteuse consiste à cibler les fibroblastes associés au mélanome (MAFs) présents dans le microenvironnement tumoral (TME), car les fibroblastes activés par le mélanome sont reconnus comme des acteurs clés dans la tumorigenèse, les métastases et la résistance thérapeutique. La compréhension du ou des mécanismes moléculaires responsables de la transition phénotypique des fibroblastes en MAFs permettra d’élaborer de nouvelles stratégies afin de les inhiber et améliorer le taux de guérison des stades avancés. La majorité des MAFs présentent des propriétés myofibroblastiques et expriment la protéine d'activation des fibroblastes α (FAPα). Cependant, le rôle de FAPα dans la transition et le maintien du phénotype MAF ainsi que les processus tumoraux contrôlant son expression sont très peu connus. Mon travail repose sur l’étude de la régulation et du rôle de FAPα dans le TME du mélanome. Dans ce contexte, nous avons investigué les molécules de signalisation qui règlent le passage phénotypique des fibroblastes cutanés en MAFs et le rôle de FAPα dans le phénotype MAF et la progression du mélanome. Nos résultats montrent que le milieu conditionné (CM) provenant d'un mélanome invasif conduit les fibroblastes à adopter un phénotype tumoral avec une augmentation des marqueurs moléculaires de MAFs comme αSMA, intégrine β1 et FAPα et pro-invasifs comme YAP. De plus, les fibroblastes traités avec le CM de mélanome invasif présentent des caractéristiques myofibroblastiques, comme la capacité à produire une matrice extracellulaire (ECM) de fibres de collagène et de fibronectine alignées. L'inhibition pharmacologique de la voie de signalisation du TGFβ1 montre que le TGFβ1 est le principal facteur sécrété par les cellules invasives, qui induit la transition phénotypique en MAF. Fait important, les propriétés myofibroblastiques des MAFs dépendent de l'expression de FAPα. L’inhibition de FAPα dans les MAFs, diminue l'expression des marqueurs moléculaires proinvasifs et supprime leur capacité à produire une matrice fibrillaire alignée. Nous avons par la suite établi un modèle cellulaire dans lequel FAPα est surexprimée dans les fibroblastes normaux. La surexpression de FAPα favorise l'expression de marqueurs de MAFs, les propriétés contractiles et le dépôt de fibres d’ECM alignées. De plus, la culture de cellules de mélanome sur des matrices 3D dérivées de fibroblastes sur-exprimant FAPα diminue leur prolifération et augmente leur migration. Des observations inverses sont obtenues lorsque les cellules de mélanome sont cultivées sur des matrices dérivées de MAFs éteints pour FAPα. En conclusion, nous montrons que TGFβ1 sécrété par des cellules de mélanome invasives est responsable de l'activation des fibroblastes cutanés en un phénotype MAF exprimant FAPα, qui s'accompagne d'une activité myofibroblastique accrue qui est importante pour le remodelage matriciel du stroma tumoral. En outre, ce remodelage de l'ECM contribue au comportement invasif et agressif du mélanome. Les travaux futurs porteront sur les cibles en aval de FAPα afin de faire la lumière sur son rôle dans le TME des mélanomes.Advanced melanoma is the most aggressive skin cancer and is notorious for its tendency to metastasise. Approximately 50% of patients with advanced melanoma experience relapse due to its intrinsic resistance to current therapies. A promising therapeutic strategy is targeting melanoma associated fibroblasts (MAFs) in the melanoma tumour microenvironment (TME) because MAFs, have been implicated as key players in melanoma progression, metastasis and drug resistance. An understanding of the molecular mechanism(s) responsible for the phenotypic switching of skin fibroblasts to MAFs will enable more diverse ways of inhibiting them. In this regard, we are interested in observations that MAFs exhibit myofibroblast properties and that they express fibroblast activation protein α (FAPα). However, whether FAPα is a key player in driving the MAF phenotype and what regulates its expression are poorly understood. To address this, we investigated: 1) the signalling molecules that regulate the phenotypic switching of skin fibroblasts to MAFs and 2) the role of FAPα in the MAF phenotype and melanoma progression. Our results show that conditioned medium (CM) from invasive melanoma stimulated skin fibroblasts to adopt a MAF phenotype, as we observed an increase in mRNA and protein levels of MAF molecular markers αSMA, β1integrin and FAPα. Moreover, skin fibroblasts treated with invasive melanoma CM exhibited myofibroblast characteristics, including the deposition of aligned ECM fibres (fibronectin and collagen) and an increase in protein expression of proinvasive molecular markers such as fibronectin, collagen I and YAP. Importantly, chemical inhibition of transforming growth factor β1 (TGFβ1) in the melanoma CM demonstrated that TGFβ1 is the key signalling molecule secreted by invasive melanoma cells, which is inducing the phenotypic switching of skin fibroblasts to MAFs. Importantly, we demonstrated that MAF myofibroblast properties are dependent on FAPα expression. Our data suggest that silencing FAPα in MAFs, significantly decreased CAF molecular and proinvasive marker expression and abolished their ability to deposit aligned ECM fibres. To further investigate the role of FAPα in the MAF phenotype, we established a cell culture model in which FAPα was overexpressed in skin fibroblasts. FAPα overexpression in skin fibroblasts promoted protein expression of several MAF and proinvasive markers, contractile capacity and the deposition of aligned ECM fibres. Interestingly, we observed a decrease in melanoma cell proliferation and an increase in their migration on aligned 3D matrices derived from FAPα overexpressing skin fibroblasts and the opposite occurred when melanoma cells were cultured on matrices derived from FAPα-silenced MAFs. We therefore concluded that TGFβ1 secreted by invasive melanoma cells is responsible for activating skin fibroblasts to a FAPα-expressing MAF phenotype, which is accompanied by enhanced myofibroblast activity and is important for ECM remodelling in the TME. Furthermore, this ECM remodelling is contributing to the aggressive melanoma behaviour. Future work will investigate the downstream targets of FAPα to shed light on its role in the melanoma TME