Desenvolvimento de antígenos recombinantes para imunodiagnóstico de sífilis

Orientador: Prof. Dr. Nilson Ivo Tonin ZanchinCoorientador: Prof. Dr. Marco Aurélio KriegerDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 30/10/2014Inclui referênciasResumo: A sífilis é uma doença sexualmente transmissível (DST), causada pela bactéria Treponema pallidum, que acomete milhões de indivíduos no mundo. A sífilis pode também ser transmitida através de transfusão sanguínea, de forma que a rede de hemocentros necessita testar todas as bolsas de sangue. No Brasil, só no ano de 2003 dados epidemiológicos do ministério da saúde indicam 843300 casos. É particularmente preocupante a prevalência de sífilis em gestantes, que pode ocasionar danos à saúde da mãe e criança. Considerando os testes realizados para controle de qualidade do sangue e de monitoramento da saúde materno-infantil, o número de testes realizados para diagnóstico de sífilis é de vários milhões por ano. Estes testes são fornecidos, em geral, por indústrias internacionais. O diagnóstico laboratorial da sífilis é realizado principalmente por testes sorológicos. A presença ou ausência de antígenos trepônemicos diferencia estes testes em: 1) não treponêmicos como o "Nontreponemal Venereal Disease Research Laboratory" (VDRL) para triagem e avaliação da resposta aos tratamentos e 2) treponêmicos diretos como ensaio de hemaglutinação (TPHA), imunofluorescência indireta (FTA-ABS) e ensaios de imunoadsorção com enzima conjugada denominada pela sigla em inglês de ELISA. A detecção direta de anticorpos antitreponêmicos depende da utilização de antígenos de Treponema e alguns antígenos recombinantes vêm sendo testados como imunoreagentes para diagnóstico. Proteínas treponêmicas clonadas e expressadas em Escherichia coli, apresentam bom desempenho em imunoensaios. Para este trabalho foram selecionadas as proteínas denominadas TpN17, TpN47, TmpA e TpN15 visando determinar o conjunto mínimo de antígenos treponêmicos para imunodiagnóstico de sífilis. Estas proteínas foram expressas em E. coli, purificadas e avaliadas seu uso em imunodiagnóstico. Os testes imunológicos foram realizados em sistema Luminex 200 utilizando painéis sorológicos validados analisados em três conjuntos de testes. A proteína TpN17 apresentou em média 100% de sensibilidade e 99,16% de especificidade com as amostras testadas. A proteína TpN47 apresentou em média 100% de sensibilidade e 98,40% de especificidade para as amostras testadas. A proteína TmpA apresentou em média 84,33% de sensibilidade e 93,03% de especificidade testada com os conjuntos de amostras. E a proteína TpN15 apresentou 97,33% de sensibilidade e 93% de especificidade em média testada com os conjuntos de amostras. Além da caracterização imunológica, as proteínas TpN17, TpN47, TpN15 e TmpA foram submetidas a caracterização biofísica visando analisar sua estabilidade, solubilidade e estado de agregação. As análises de CD (Dicroísmo Circular) indicam que as proteínas TpN17, TpN47, TpN15 e TmpA, são estruturadas e são termicamente estáveis até temperaturas próximas de 35ºC. As análises de DLS (Espalhamento Dinâmico de Luz) demonstraram que as proteínas TpN17, TpN47, TpN15 e TmpA não apresentam agregados tendo a qualidade necessária para imunoensaios.Abstract: Syphilis is a sexually transmitted disease (STD) caused by the bacterium Treponema pallidum, which affects millions of individuals worldwide. Syphilis can also be transmitted through blood transfusion, so that the network of blood centers need to test all blood bags. In Brazil, only in 2003 epidemiological data from the health ministry show 843 300 cases. Of particular concern is the prevalence of syphilis in pregnant women, which can cause damage to the health of mother and child. Considering the tests for quality control of blood and monitoring of maternal and child health, the number of tests for syphilis is several million per year. These tests are provided in general by international industry. The laboratory diagnosis of syphilis is performed mainly by serological tests. The presence or absence of treponemal antigens differentiates these tests: 1) nontreponemal as "Nontreponemal Venereal Disease Research Laboratory" (VDRL) for screening and assessment of response to treatment and 2) as direct treponemal hemagglutination assay (TPHA), immunofluorescence indirect (FTAABS) tests and enzyme-linked immunosorbent assay coupled called by the acronym ELISA. The direct detection of anti-treponemal antibodies depends on the use of antigens of Treponema and some recombinant antigens have been tested as immune reagents for diagnosis. Treponemic proteins cloned and expressed in Escherichia coli, have good performance in immunoassays. For this work we selected the proteins called TpN17, TpN47, TpN15 and TmpA to determine the minimum set of treponemal antigens for immunodiagnosis of syphilis. These proteins were expressed in E. coli, purified, and evaluated their use in immunodiagnosis. Immunological tests were performed on the Luminex 200 system using validated serological panels analyzed into three sets of tests. The TpN17 protein showed an average 100% sensitivity and 99.16% specificity with the tested samples. The TpN47 protein showed an average 100% sensitivity and 98.40% specificity for the tested samples. The TmpA protein showed an average 84.33% sensitivity and 93.03% specificity tested with sets of samples. And TpN15 protein showed 97.33% sensitivity and 93% specificity on average tested with sets of samples. Besides the immunological characterization, the TpN17, TpN47, TpN15 and TmpA proteins were subjected to biophysical characterization in order to analyze its stability, solubility and physical state. Analyses of CD (Circular Dichroism) indicate that TpN17, TpN47, TpN15 and TmpA proteins, are structured and are thermally stable up to temperatures close to 35 °C. The analyzes of DLS (Dynamic Light Scattering) showed that TpN17, TpN47, TpN15 and TmpA proteins not present aggregates having the quality required for immunoassays