Caracterização bioquímica da proteína NifAQ6 de Herbaspirillum seropedicae

Orientador: Prof. Dr. Emanuel Maltempi de SouzaCoorientador: Dr. Adriano Alves StefanelloDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Defesa : Curitiba, 29/04/2020Inclui referências: p. 60-67Resumo: Herbaspirillum seropedicae é uma Betaproteobacteria diazotrófica encontrada em associação com gramíneas de interesse econômico, como sorgo, milho e arroz. A fixação de nitrogênio em H. seropedicae é finamente regulada a nível transcricional pela proteína NifA. A proteína NifA é uma ativadora transcricional dos genes nif e pertence à família de ativadores transcricionais dependentes de ?54. A regulação da atividade dessa proteína depende dos níveis de amônio e oxigênio disponíveis. A regulação da atividade de NifA por amônio ocorre por meio de uma possível interação de seu domínio GAF N-terminal com proteínas da família PII, GlnB e GlnK, enquanto a regulação por oxigênio envolve um conjunto de 4 cisteínas regularmente espaçadas (Cys-X11-X19-Cys-X4-Cys) localizadas ao final do domínio AAA+ e início do interdomínio ID. Um trabalho anterior mostrou que uma proteína quimérica (NifAQ6) contendo a região C-terminal da NifA de A. vinelandii (posição 417 até 522) e a região N-terminal da proteína NifA de H.seropedicae (posição 1 até 409) não possui sensibilidade ao oxigênio e mantém o mesmo padrão de regulação por amônio observado em NifA de H. seropedicae, o que facilita o estudo da regulação da atividade de NifA por GlnK. Sabendo disso, o objetivo geral deste trabalho foi entender o mecanismo de regulação da atividade da proteína NifA de H. seropedicae pelas proteínas PII, através da caracterização in vitro da interação entre a proteína NifAQ6 e proteínas PII de H. seropedicae. Para isso, as proteínas NifAQ6, GlnK e GlnB, foram superexpressas em E. coli, purificadas, e utilizadas em ensaios de pull-down que mostraram a interação direta entre NifA e proteínas PII independente da presença ou ausência dos efetores 2OG, ATP e ADP. Palavras-chave: NifA, Proteínas PII, Herbaspirillum seropedicae.Abstract: Herbaspirillum seropedicae is a diazotrophic Betaproteobacterium found in association with grasses of economic interest such as sorghum, maize, and rice. Nitrogen fixation in H. seropedicae is finely regulated at the transcriptional level by the NifA protein. NifA is a transcriptional activator of the nitrogen fixation related nif genes, and belongs to the family of ?54-dependent transcriptional activators. The regulation of this protein's activity depends on the available nitrogen and oxygen levels. Ammonium regulation works by means of the proposed interaction of the NifA N-terminal GAF domain with the PII family proteins, GlnB and GlnK, which are able to activate NifA, while the oxygen control involves a set of 4 cysteines (Cys-X11-X19-Cys-X4-Cys), located at the end of the AAA + domain and at the beginning of the interdomain ID. A previous study found that a chimeric protein (called NifAQ6), which contains the C-terminal region of A. vinelandii NifA (positions 417 to 522) and the N-terminal region of the H. seropedicae NifA protein (positions 1 to 409), has been shown to have no oxygen sensitivity while retaining the ammonium regulation characteristic of H. seropedicae NifA, which facilitates the study of NifA activation by GlnK in vitro. Thus, the general objective of this work was to probe the mechanism of activity control of H. seropedicae NifA protein by PII proteins, through the in vitro characterization of the interaction of NifAQ6 and the PII proteins of H. seropedicae. For this, the proteins NifAQ6, GlnK and GlnB were overexpressed in E. coli, purified, and used for pull-down assays which showed the direct interaction between NifA and PII proteins regardless of the presence or absence of the common PII effectors 2- oxoglutarate, ATP and ADP. Palavras-chave: NifA, PII proteins, Herbaspirillum seropedicae