Biosynthetic studies of bioactive macrolactone polyketide from Streptomyces sp. ICBG311

Os produtos naturais desempenham um importante papel na descoberta e no desenvolvimento de novos fármacos. Neste contexto, os micro-organismos possuem notável contribuição, visto que são profícuos produtores de metabólitos secundários ativos frente aos mais diversos patógenos. Em função disso, a associação com micro-organismos se mostrou uma importante vantagem evolutiva para os mais diversos seres vivos como plantas, insetos e diversos outros animais. Um exemplo bem conhecido desse tipo de simbiose é associação de formigas da subtribo Attina com actinobactérias que produzem compostos ativos frente patógenos específicos que ameaçam a colônia das formigas. Em estudos recentes realizados no Laboratório de Química de Micro-organismos (LQMo - FCFRP) foram identificados, a partir do cultivo da actinobactéria Streptomyces sp. ICBG311, isolada de machos alados de formigas criadoras de fungos Cyphomyrmex, três policetídeos estruturalmente relacionados, sendo um deles inédito, a cifomicina (15), e dois já descritos na literatura, caniferolídeo C (16) e GT-35 (17). Os compostos apresentaram potencial antifúngico contra linhagens de fungo entomopatogênico e também contra patógenos humanos, além de elevada atividade antiparasitária frente as formas amastigotas intracelulares e promastigotas de Leishmania donovani. Dispondo dessas informações, o presente projeto contribuiu com a determinação da via de biossíntese da cifomicina e seus análogos e com a avaliação da produção dos compostos em diferentes condições de cultivo. A partir de análises do genoma de Streptomyces sp. ICBG311 usando o software AntiSMASH, foi identificado o cluster de genes biossintéticos (BGC) 1.4 que possui 220 Kpb de comprimento, contendo 83 genes, sendo 25 deles putativamente relacionados com a biossíntese dos compostos 15-17. O esqueleto policetídico é biossintetizado por uma policetídeo sintase (PKS) tipo I, e posteriormente modificado por citocromos P450 que promovem oxidações pontuais que marcam as diferenças entre os três compostos. Os açúcares presentes nas estruturas são biossintetizados a partir da glicose-1-fosfato pela ação de nove enzimas, e por fim, a alquilnaftoquinona tem como precursor biossintético um intermediário da via da menaquinona e o restante de sua biossíntese é realizada pelo produto de três outros genes. Com o objetivo de otimizar as condições de cultivo, a linhagem ICBG311 foi cultivada em diversos meio de cultura, porém a produção dos compostos não foi reprodutível na maioria das condições testadas, com a exceção do meio ISP2 ágar. O cultivo da linhagem ICBG311 em meio ISP2 ágar também se destacou nas análises metabolômicas usando dados de LC-ESI-MS/MS e a plataforma \"Global Natural Product Social Molecular Networking\" (GNPS), apresentando 53 íons que não estavam presentes nos extratos dos cultivos em outros meios de cultura. Com isso, o meio ISP2 ágar se mostrou promissor tanto para a produção dos compostos 15-17 como para explorar o potencial biossintético apresentado por essa actinobactéria. Sendo assim, este trabalho relata a via de biossíntese da cifomicina e seus análogos, além de contribuir com a determinação das condições de cultivo que podem ser utilizadas em trabalhos futuros com a linhagem bacteriana.Natural products play an important role in the discovery and development of new drugs. In this context, microorganisms have a remarkable contribution since they are capable of producing several secondary metabolites that are active against different pathogens. The association with microorganisms proved to be an important evolutionary advantage for the most diverse living beings such as plants, insects, and animals. A well elucidate example of this kind of symbiosis is the association of fungus-growing ants of Attina subtribe with actinobacteria, which produce active compounds against specific parasites that threaten the ant colony. In recent studies carried out at the Lab of Microbial Chemistry (LQMo - FCFRP), three chemically related polyketides were identified from the culture of the actinobacteria Streptomyces sp. ICBG311, isolated from a winged male of Cyphomyrmex fungus-growing ant, the novel compound, cyphomycin (15), and two analogues already reported, caniferolide C (16) and GT-35 (17). The compounds presented antifungal potential against entomopathogenic fungus strains and also against human pathogens, in addition to high antiparasitic activity against intracellular amastigote and promastigote forms of Leishmania donovani. In this context, this project contributed to the knowledge about the biosynthetic pathway of cyphomycin and analogs, besides the evaluation of the compounds production in different culture conditions. By analyzing Streptomyces sp. ICBG311\'s genome on AntiSMASH software, the biosynthetic gene cluster (BGC) 1.4 was identified as responsible for the biosynthesis. The BGC is 220 Kb in length containing 83 genes, 25 of them are putatively related to the biosynthesis of compounds 15-17. The polyketide chain is biosynthesized by a type I polyketide synthase (PKS), and modified by cytochrome P450 enzymes that promote punctual oxidations that lead to the differences observed among the three compounds. Sugar biosynthesis starts with glucose-1-phosphate and is performed by nine enzymes. Finally, an intermediate of menaquinone pathway is used as the precursor for the alkylnaphthoquinone biosynthesis, which is completed by the product of three other genes. Aiming to optimize culture conditions, Streptomyces sp. ICBG311 was cultivated in several culture media. However, the production of compounds 15-17 was not reproducible in most of the tested conditions, except for ISP2 agar media. ICBG311 culture in ISP2 agar also presented 53 exclusive ions, when compared with the other media tested, on the metabolomics analyses performed with the LC-ESI-MS/MS data at the Global Natural Product Social Molecular Networking (GNPS) platform. Based on that, ISP2 agar is a promising culture media for future studies regarding the compounds 15-17 production, and the biosynthetic potential presented by the strain ICBG311. Therefore, this study reports the biosynthetic pathway of cyphomycin and analogs and contributes to the optimization of the strain ICBG311 culture conditions for future studies