Antinociceptive and anti-inflammatory activities of Copaifera pubiflora Benth oleoresin and its major metabolite ent-hardwickiic acid

Os nomes populares das espécies de copaífera são \"copaíbas, copaibeiras, copaívas ou pau d\'óleo \", amplamente utilizadas na medicina popular brasileira. Dentre todas as aplicações etnofarmacológicas descritas para oleorresinas de Copaifera spp, destacam-se seus efeitos anti-inflamatórios e analgésicos. No entanto, o conhecimento das propriedades anti-inflamatórias e antinociceptivas da Copaifera pubiflora Benth é escasso. Levando isso em conta, investigaram-se as atividades citotóxica, anti-inflamatória e antinociceptiva da oleorresina de Copaifera pubiflora (OCP) e de seu metabólito majoritário, ácido ent-hardwickiico (AH). O ensaio de fosfatase ácida foi utilizado para avaliar a citotoxicidade da OCP e do AH em três diferentes linhagens celulares. As doses de 1, 3 e 10 mg/kg da OCP e do AH foram empregadas nos ensaios biológicos. A avaliação da atividade motora foi realizada por meio de testes de campo aberto e Rota Rod. A atividade anti-inflamatória da OCP e do AH foi avaliada utilizando-se os seguintes ensaios farmacológicos: edema de pata induzido por carragenina, hiperalgesia induzida por carragenina, determinação de INF-&gamma;, IL-1&beta;, IL-6, IL-10 e TNF-&alpha; em um sistema multi-spot ultilizando a linhagem celular imortalizada THP-1, artrite induzida por zymosan e pelo ensaio da luciferase. Os testes de formalina e contorções abdominais induzidas por ácido acético foram realizados para avaliar o potencial antinociceptivo da OCP e do AH. O teste de retirada de cauda (Tail-flick) foi ultilizado para avaliar possíveis efeitos centrais da OCP e do AH. Na avaliação da citotoxicidade, a OCP e o AH não foram citotóxicos para as linhagens testadas. A OCP e o HA (10 mg/kg) não afetaram a capacidade locomotora dos animais nos testes de campo aberto e Rota Rod. No edema de pata induzido por carragenina o AH e a OCP apresentaram inibições significativas, sendo as doses de 10 mg/kg as mais eficazes, registrando inibições máximas de 58 ± 8% e 76 ± 6%, respectivamente, p <0,05. Tanto AH quanto OCP diminuíram significativamente a intensidade da hipernocicepção inflamatória no ensaio de hiperalgesia induzida por carragenina em todas as doses testadas, sendo a dose de 10 mg/kg a mais eficaz com inibições máximas de 74 ± 2% (p <0,05) e 76 ± 3% (p <0,01) respectivamente. Em células THP-1 estimuladas por LPS, os tratamentos com AH e OCP diminuíram os níveis de INF-&gamma;, IL-1&beta;, IL-6, IL-10 e TNF-&alpha; em 24 e 72 h. Na artrite induzida por zymosan, a OCP e o AH diminuíram o número de neutrófilos na articulação de camundongos artríticos e o número de leucócitos totais (p <0,05). Além disso, o AH e a OCP diminuiram significativamente o edema das articulações (p <0,05). A OCP e o AH também aumentaram o limiar mecânico durante a artrite experimental (p <0,05). No ensaio da luciferase, a OCP e o AH reduziram significativamente a atividade da enzima luciferase (p <0,05). Esta redução indica uma diminuição na atividade do NF-&kappa;B. O comportamento nociceptivo foi reduzido pela OCP e pelo AH em ambas as fases da formalina em todas as doses testadas. As doses mais altas testadas exibiram inibições de 87 ± 1% e 72 ± 4%, respectivamente, p <0,001, na primeira fase, e 87 ± 1% e 81 ± 2%, respectivamente, p <0,001, na segunda fase. O tratamento oral com a OCP e com o AH (1, 3, 10 mg / kg) reduziu significativamente a resposta nociceptiva das contorções abdominais induzidas por ácido acético e a dose de 10 mg/kg foi a mais eficaz com inibições ii máximas de 86 ± 2% e 82 ± 1%, respectivamente, p <0,001. A administração de OCP e AH (10 mg/kg) não afetou significativamente as latências de retirada da cauda dos camundongos em comparação com a morfina utilizada como controle. A administração concomitante de OCP e AH com naloxona afetaram as latências do movimento da cauda apenas parcialmente, tendo a naloxona antagonizado os efeitos da morfina. Os resultados apresentados neste trabalho são inéditos, tendo em vista que é escasso na literatura dados farmacológicos sobre a Copaifera pubiflora Benth. Outrossim, os achados farmacológicos apresentados sugerem que a OCP e o AH podem inibir a produção de citocinas inflamatórias pela supressão da via de sinalização do NF-&kappa;B, resultando em atividades anti-inflamatórias e antinociceptivas. Ainda, estes resultados contribuem para a confirmação das atividades farmacológicas atribuídas popularmente para a espécie, sendo que pela primeira vez observou-se que a oleorresina é efetiva para o tratamento de doenças inflamatórias, tornando a planta alvo para estudos mais aprofundados dos mecanismos de ação farmacológicos envolvidos, fornecendo subsídios para estudos posteriores que poderão servir ao desenvolvimento de um novo fitoterápico.Copaifera species folkloric names are \"copaíbas, copaibeiras, copaívas or oil stick\", which are widely used in Brazilian folk medicine. Among all ethnopharmacological applications described for Copaifera spp oleoresins, their anti-inflammatory effect stands out. However, the knowledge of anti-inflammatory and antinociceptive properties of Copaifera pubiflora Benth is scarce. Therefore, we investigated the cytotoxic, anti-inflammatory, and antinociceptive activities of Copaifera pubiflora oleoresin (OCP) and its major compound ent-hardwickiic acid (AH). The phosphatase assay was used to evaluate the cytotoxicity of OCP and AH in three different cell lines. OCP and AH doses of 1, 3, and 10 mg/kg were employed in the biological assays. The assessment of motor activity was performed using open-field and rotarod tests. Anti-inflammatory activity of OCP and AH was assessed through carrageenan-induced paw edema, carrageenan-induced hyperalgesia, measurement of INF-&gamma;, IL-1&beta;, IL-6, IL-10, and TNF-&alpha; in a multi-spot system with the immortalized cell line THP-1, zymosan-induced arthritis, and luciferase assay. Formalin test and acetic acid-induced abdominal writhing were undertaken to evaluate the antinociceptive potential of OCP and AH. A tail-flick test was used to evaluate possible central OCP and AH actions. In the cytotoxicity evaluation, OCP and AH were not cytotoxic to the cell lines tested. OCP and AH (10 mg/kg) did not affect animals\' locomotor capacity in both open-field and rotarod tests. AH and OCP significantly inhibited the carrageenan-induced paw edema, being the doses of 10 mg/kg the most effective, registering maximum inhibitions of 58 ± 8% and 76 ± 6% respectively, p <0.05. Both AH and OCP significantly decreased the intensity of mechanical inflammatory hyper-nociception on carrageenan-induced hyperalgesia at all tested doses, and 10 mg/kg was the most effective dose with maximum inhibitions of 74 ± 2% (p <0.05) and 76 ± 3% (p <0,01), respectively. AH and OCP decreased INF-&gamma;, IL-1&beta;, IL-6, IL-10, and TNF-&alpha; levels at 24 and 72 h in the multi-spot system. In zymosan-induced arthritis, OCP and AH decreased the number of neutrophils in arthritic mice joints and the number of total leukocytes (p<0.05). In experimental arthritis, AH and OCP significantly decreased joint swelling (p<0.05). OCP and AH also increased the mechanical threshold during experimental arthritis. In the luciferase assay, OCP and AH significantly reduced luciferase activity (p<0.05). This reduction indicates a decrease in NF-&kappa;B activity. OCP and AH reduced the nociceptive behavior in both phases of formalin at all tested doses. The highest doses tested displayed inhibitions of 87 ± 1% and 72 ± 4%, respectively, p < 0.001, in the first phase, and 87 ± 1% and 81 ± 2%, respectively, p < 0.001, in the second phase. Oral treatment of OCP and AH (1, 3, 10 mg/kg) significantly reduced the nociceptive response in acetic acid-induced abdominal writhings, and the 10 mg/kg dose was the most effective with maximum inhibitions of 86 ± 2% and 82 ± 1%, respectively, p