Establishment of the tridimensional (3D) culture using ovarian cancer cells as platform to cytotoxicity assays

Para que um novo medicamento chegue ao mercado, estima-se que sejam necessários 10 anos de desenvolvimento com um custo aproximado de 2,6 bilhões de dólare. Além disso, a determinação da toxicidade desse medicamento durante seu desenvolvimento corresponde a um dos principais desafios, uma vez 98% dos novos candidatos a fármacos falham em segurança e eficácia. Embora modelos in vivo tenham sido amplamente utilizados para avaliar a toxicidade de diferentes susbtâncias, diversas limitações estão associadas à sua utilização como alto custo, elevado número de animais, variabilidade de procedimentos empregados e aspectos éticos. Em função disso, ensaios in vitro baseados em cultura de células vêm sendo utilizados por apresentar um melhor custo-benefício, maior reprodutibilidade e possibilidade de aplicação em plataformas de triagem automatizada em larga escala (HTS). No entanto, uma vez que o cultivo celular em monocamada (2D) tradicional pode não predizer de maneira adequada o que ocorre no ambiente in vivo, a utilização do cultivo celular tridimensional (3D) está ganhando cada vez mais importância, por reproduzir diversas características do ambiente nativo, tais como: heterogeneidade celular, interação célula-célula e célula-matriz extracelular, perfil de expressão gênica, cinética de crescimento, perfil de resistência à fármacos, dentre outros. O câncer de ovário é o sétimo tumor mais comum, sendo que o principal desafio durante seu tratamento é a frequente quimioresistência adquirida pelas pacientes. Este trabalho teve como objetivo avaliar diferentes técnicas de cultivos 3D utilizando células de adenocarcinoma de ovário (SKOV-3 e OVCAR-3) com o intuito de estabelecer um modelo in vitro para ensaios de toxicidade com maior capacidade preditiva. Para isso, o cultivo celular 3D foi realizado na forma de esferoides utilizando as técnicas de flutuação forçada (FF) e hanging-drop (HD) em mono (SKOV-3 e OVCAR-3) e co-cultura (SKOV-3:células mesenquimais-MCU-9 e SKOV-3:fibroblastos-CCD27-Sk) e em sistemas híbridos (esferoides obtidos em biorreatores do tipo spinner encapsulados em matriz de alginato) em mono (SKOV-3) e co-cultura (SKOV-3:fibroblastos-HDFs). Os esferoides obtidos nos diferentes sistemas foram avaliados em função de sua morfologia (diâmetro, circularidade e estrutura organizacional), crescimento e viabilidade celular, perfil de expressão gênica e resposta após exposição ao fármaco Paclitaxel. Inicialmente, esferoides obtidos com as células SKOV-3 e OVCAR-3 apresentaram-se pouco compactos e, em função disso, foi necessária a aplicação de um estímulo externo à técnica FF (centrifugação da placa ULA) e adição da metilcelulose (MC) ao meio de cultura (0,25% e 0,5%, p/v). Após adição da MC (FF e HD), esferoides mais esféricos com diâmetros em torno de 200-500 μm, com maior número de microvilosidades, menor taxa de crescimento e maior conteúdo apoptótico foram obtidos, quando comparado ao cultivo 2D. Co-culturas (SKOV-3:MCU-9 e SKOV-3:CCD27-Sk) obtidas utilizando a técnica FF também formaram esferoides regulares com diâmetros em torno de 200-500 μm, com maior presença de microvilosidades. A associação das células SKOV-3 com células mesenquimais em 3D propiciou uma melhor recapitulação do ambiente tumoral in vivo devido ao perfil de expressão dos genes avaliados (MMP-2, MMP-9, HIF1-α, VEGF, SNAIL, ZEB1, vimentina e β-catenina). Todos os sistemas 3D (FF e HD) apresentaram maior resistência após exposição ao fármaco Paclitaxel, quando comparado ao cultivo em 2D. Já o sistema híbrido obtido após formação dos esferoides em biorreatores do tipo spinner (SKOV-3) propiciou um maior número esferoides ao final de 21 dias de cultivo, quando comparado às técnicas FF e HD, com manutenção da viabilidade celular durante todo o cultivo. Não foi observada a fusão dos esferoides ao longo da cultura após encapsulação em alginato. Assim como para os sistemas estáticos (FF e HD), as cápsulas em mono-SKOV-3 (IC50= 11,48 μg/mL) e co-cultura- SKOV-3:HDFs (IC50 = 17,63 μg/mL) demonstraram maior resistência ao Paclitaxel, quando comparadas ao cultivo 2D (IC50 = 5,13 μg/mL). Os resultados apresentados ao longo deste trabalho sugerem que a co-cultura SKOV-3:MCU-9 apresenta melhores características para ensaios drug screenig em um curto período, em função da facilidade de obtenção, recapitulação da resposta celular in vivo e custo-benefício. Já a co-cultura em sistema híbrido SKOV-3:HDFs pode ser utilizada para ensaios a longo termo, em função da viabilidade e resposta da cultura. Além disso, os resultados obtidos podem contribuir para a consolidação e padronização dos sistemas de cultivo celular 3D para o screening de novos fármacos para o tratamento do câncer.For a new drug reaching the market 10 years of development are estimated, with a cost of approximately US$2.6 billion. One of the main challenges in developing a new drug is the determination of its toxicity, once that 98% of new drugs fail in safety and efficacy assays. Although in vivo models have been widely used to evaluate the toxicity of the different compounds, several limitations can be associated with their use such as need of high number of animals, variability and ethical aspects. As a result, in vitro assays based on cell culture are being used once they present better cost, higher reproducibility and possibility of application in high throughput screening platforms (HTS). However, as cell culture in monolayer (2D) can\'t predict adequately what occurs in the in vivo environment, the use of three-dimensional (3D) cell culture achieve importance due to the reproduction of the several characteristics of the native environment, such as: cell heterogeneity, cellcell and cell-extracellular matrix interaction, gene expression profile, growth kinetics, drug resistance profile, among others. Ovarian cancer is the seventh most common tumor and the main challenge during its treatment is the frequent chemoresistance acquired by the by patients. This study aimed to evaluate different 3D cell culture techniques using ovarian adenocarcinoma cells (SKOV-3 and OVCAR-3) in order to establish an in vitro model for toxicity assays with higher predictive capacity. For this, 3D cell culture was performed in the form of spheroids, using forced floating (FF) and hangingdrop (HD) techniques in mono (SKOV-3 and OVCAR-3) and co-cultures (SKOV-3: mesenchymal cellsMCU-9and SKOV-3:fibroblasts-CCD27-Sk) and hybrid systems (spheroids obtained in spinner-type bioreactor encapsulated in alginate matrix) in mono (SKOV-3) and co-culture (SKOV-3:fibroblastHDFs). The spheroids obtained in the different systems were evaluated according to their morphology (diameter, circularity and structure organization), cell growth and viability, gene expression profile and response after exposure to the drug Paclitaxel. Initially, spheroids obtained with SKOV-3 and OVCAR3 cells presented low compaction and, as a result, it was necessary applying an external stimulus to the FF technique (centrifugation of the ULA plate) and the addition of methylcellulose (MC) to culture medium (0.25% and 0.5%, w/v). After addition of MC (FF and HD), more spherical spheroids with diameters around 200-500 µm, with the presence of a higher number of microvilli, lower growth profile and higher apoptotic content were obtained, when compared to 2D culture. Co-cultures (SKOV3:MCU-9 and SKOV-3:CCD27-Sk) obtained using the FF technique also formed regular spheroids with diameters of 200-500 µm, with higher presence of microvilli. The association of SKOV-3 cells with mesenchymal cells in 3D provided a better recapitulation of the in vivo tumor environment due to the expression profile of the genes evaluated (MMP-2, MMP-9, HIF1-α, VEGF, SNAIL, ZEB1, vimentin and β-catenin). All of the spheroids obtained in 3D systems evaluated (FF and HD) showed higher resistance after exposure to the Paclitaxel drug, when compared to 2D culture. The hybrid system obtained after spheroid formation in spinner bioreactor (SKOV-3) provided a higher number of spheroids at the end of 21 days of the culture, when compared to the FF and HD techniques, maintaining the cell viability. Spheroid fusion was not observed throughout the culture after encapsulation in alginate. As for static systems (FF and HD), capsules in mono-SKOV-3 (IC50 = 11.48 µg/mL) and co-culture-SKOV-3:HDFs (IC50 = 17.63 µg/mL) demonstrated higher resistance to Paclitaxel, when compared to 2D culture (IC50 = 5.13 µg/mL). The results presented suggest that the co-culture SKOV-3:MCU-9 is adequate for short-term drug screening assays, due to its ease of spheroids obtaining, recapitulation of the in vivo cellular response and cost-effectiveness. Co-culture in SKOV-3:HDFs in hybrid system could be used for long term assays, due to their viability and response of the culture. In addition, the results may contribute to the consolidation and standardization of 3D cell culture systems for drug screening of new drugs for cancer treatment