Expressão alterada de microRNAs e seu papel na resistência de células Bcr-Abl+ à terapia com TKI

Chronic myeloid leukemia (CML) is a myeloproliferative neoplasm characterized by stem cell deregulation and increased myeloid proliferation without impairment of differentiation capacity. The hematopoiesis deregulation arises from the formation of a Bcr-Abl oncoprotein with constitutive tyrosine kinase (TK) activity, responsible for the malignant cell transformation. The tyrosine kinase inhibitors (TKI) therapy changed dramatically the CML natural history, promoting high rates of disease remissions in patients. However, at least 25% of CML patients are resistant to TKI therapy. Despite all the knowledge about the pathogenesis and progression of CML, the cellular and molecular mechanisms underlying the TKI-resistance are not fully understood. Therefore, we supposed that microRNAs deregulated expression contributes to IM-resistance in Bcr-Abl+ cells. MicroRNAs are small endogenous RNAs that regulate gene expression. The changes of microRNAs expression have been associated with the pathogenesis of different neoplasms, and the role of microRNAs in the development of resistance to drug-therapies was already demonstrated in a wide range of cancers. In this current investigation, we hypothesized that the inhibition of specific microRNAs could sensitize Bcr-Abl+ resistant cells to the TKI imatinib mesylate (IM) therapy. The expression of miR-125a-5p, miR-125b, and miR-132 was assessed in 61 CML patients, of which 10 samples were from newly diagnosed patients, 15 from patients in the advanced stages of the disease (accelerated phase and blast crisis), and 36 samples from patients in the disease remission after IM or dasatinib (DAS) therapy. The miR-125b was less expressed in the patients in the disease remission after DAS treatment than in the newly diagnosed patients and patients in the advanced stages. Other five microRNAs up-regulated in Bcr-Abl+ cells were selected using the NanoString\'s microRNA panel (miR-23a, miR-24, miR-155, miR-222, and miR-342). Then, the transient and stable inhibition of all the above mentioned microRNAs was performed in the IM-resistant Bcr-Abl+ cell line, LAMA-84R. The inhibition of miR-125a-5p, miR-132, and miR-23a did not sensitize the LAMA-84R cells to IM treatment. The inhibition of miR-125b, miR-24, miR-155, miR-222, and miR-342 promoted a modest increase of LAMA-84R cells sensitivity to the IM treatment. Additionally, the miR-222 and miR-342 overexpression in LAMA-84S, the sensitive counterpart of LAMA-84R, didn\'t promote the cells\' resistance to the IM treatment. A new approach was performed to select the microRNAs that are strongly associated with IM-resistance, the phenotypic screen based on the pLX-miR Library. After Next-Generation sequencing analysis, let-7e, miR-181a, miR-484, miR-616, and miR-96 were selected. These microRNAs expression was assessed in the patients groups. All the five microRNAs were less expressed in the patients in the disease remission after IM treatment than in the newly diagnosed patients. Currently, we are validating the results obtained from the phenotypic screen by the individual knockout of the five microRNAs through the CRISPR-Cas9 gene-editing system. The results will contribute to elucidate the mechanisms involved in CML resistance to imatinib mesylate and to describe new therapeutic targets that are independent of the Bcr-Abl oncoprotein.A leucemia mieloide crônica (LMC) é uma neoplasia mieloproliferativa caracterizada pela alteração de células-tronco hematopoéticas e aumento da proliferação de células mieloides, as quais mantém sua capacidade de diferenciação. A oncoproteína Bcr-Abl com atividade tirosina-quinase constitutiva (TK) é a responsável pela transformação maligna. A terapia com os inibidores de tirosina-quinase (TKI) é capaz de promover altas taxas de remissão da doença. No entanto, ao menos 25% dos pacientes com LMC são resistentes à terapia com TKI. Apesar de todo o conhecimento sobre a fisiopatologia e progressão da LMC, os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à resistência aos TKI não estão completamente elucidados. Nesse contexto, acreditamos que os microRNAs podem contribuir para a resistência das células Bcr-Abl+ ao IM. Os microRNAs são pequenos RNAs endógenos que regulam a expressão gênica. Alterações na expressão de microRNAs tem sido associadas à patogênese de diferentes neoplasias e seu papel no desenvolvimento de resistência à terapias medicamentosas já foi demonstrado em numerosos tipos de câncer. Dessa forma, partimos da hipótese de que a inibição de microRNAs específicos é capaz de sensibilizar células Bcr-Abl+ resistentes à terapia com o IM. A expressão do miR-125a-5p, miR-125b e miR-132 foi avaliada em 61 pacientes com LMC (10 amostras de pacientes ao diagnóstico da LMC, 15 amostras de pacientes nas fases avançadas da doença - fase acelerada e crise blástica - e 36 amostras de pacientes em remissão após o tratamento com IM ou dasatinibe (DAS)). O miR125b foi menos expresso no grupo de pacientes em remissão após tratamento com DAS que nos grupos de pacientes ao diagnóstico ou nas fases avançadas da doença. Outros cinco microRNAs up-regulados em células Bcr-Abl+ foram selecionados através do painel NanoStringTM de microRNAs (miR-23a, miR-24, miR-155, miR-222 e miR-342). A inibição transiente e estável de todos os microRNAs acima citados foi realizada na linhagem celular Bcr-Abl+ resistente ao IM, LAMA-84R. A inibição do miR-125a-5p, miR-132 e miR-23a não foi capaz de sensibilizar as células LAMA-84R ao IM, ao passo que a inibição do miR-125b, miR-24, miR-155, miR-222 e miR-342 promoveu um pequeno aumento de sensibilidade das células LAMA-84R ao IM. Além disso, a superexpressão do miR-222 e do miR-342 na linhagem celular Bcr-Abl+ sensível ao IM, LAMA-84S, não promoveu a resistência dessas células ao IM. Uma nova abordagem para selecionar microRNAs fortemente associados à resistência ao IM foi realizada, o screen fenotípico baseado na pLX-miR library. Após a análise de sequenciamento de última geração, os microRNAs let-7e, miR-181a, miR-484, miR-616 e miR-96 foram selecionados. A expressão de tais microRNAs foi avaliada nos grupos de pacientes e todos os cinco foram menos expressos nos pacientes em remissão após o tratamento com IM que nos pacientes ao diagnóstico da LMC. Atualmente, os resultados obtidos desta triagem fenotípica estão sendo validados através do nocaute individual dos cinco microRNAs por meio da técnica de edição gênica CRISPR-Cas9. Os resultados obtidos contribuirão para elucidar os mecanismos envolvidos na resistência da LMC ao IM e para a descrição de novos alvos terapêuticos independentes da oncoproteína Bcr-Abl