Discovery of antiviral candidates based on the yellow fever virus enzyme NS5 RNA-dependent RNA polymerase

O ressurgimento da febre amarela em regiões não-endêmicas do Brasil e do continente africano entre 2016 a 2018, colocou em risco regiões urbanas com alta densidade populacional e baixa cobertura vacinal. A ausência de um tratamento para a febre amarela, assim como a necessidade de fármacos para o controle de vírus emergentes, reforça a importância na busca por novos antivirais. O objetivo deste trabalho foi a busca de candidatos antivirais a partir da enzima NS5 RNA polimerase RNA-dependente (RdRp) do vírus da febre amarela. Para este propósito, a produção da forma recombinante dessa enzima, assim como, dois ensaios de elongação de uma fita de RNA foram padronizados. O primeiro consistiu no uso de nucleotídeos modificados e uma reação acoplada à fosfatase alcalina, enquanto no segundo, a atividade da proteína foi medida pela sonda intercalante SYBR Green I (SGI). O ensaio com a sonda SGI apresentou maiores intensidades de fluorescência e maior facilidade na implementação em experimentos de média escala, logo, ele foi escolhido para a busca e caracterização de inibidores. Em seguida, realizou-se a triagem da biblioteca de compostos MMV/DNDi Pandemic Response Box e foram identificadas 25 moléculas como inibidores da RdRp. Diversos compostos apresentaram potência inibitória na faixa de nanomolar, indicando a possível presença de falsos-positivos na triagem. As moléculas foram validadas por ensaios de interferência ao SGI e 18 compostos interferiram de maneira significativa com a sonda. Dentre os inibidores considerados confiáveis pelo contra-ensaio, a Clofazimina, TTP-8307 e MMV218827 apresentaram potência inibitória na faixa de 0.2 a 4 micromolar. Apesar da alta potência demonstrada pelo MMV218827 (IC50 = 0.2 μM), ele foi desconsiderado como um candidato promissor após desestabilizar a RdRp em ensaios de fluorimetria de varredura diferencial e, também, por pertencer a uma classe de moléculas que causam inibição inespecíficas em proteínas. A Clofazimina (IC50 = 4 μM) e TTP-8307 (IC50 = 4 μM) aumentaram a estabilidade da proteína e apresentaram estruturas químicas inéditas para inibidores de RdRp, expandindo o desenvolvimento de novas moléculas para esse alvo. Ensaios de cristalização também foram realizados, no entanto, não foi possível obter cristais da proteína. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que o ensaio de elongação com a sonda SGI pode ser utilizado para triagens de inibidores da RdRp do vírus da febre amarela, com a Clofazimina e o TTP- 8307 sendo estes possíveis candidatos a antivirais para esse vírus, contudo, serão necessários estudos futuros para a avaliação de suas atividades em células.The yellow fever resurgence in non-endemic regions of Brazil and Africa between 2016 and 2018, put at risk urban regions with high population density and low vaccination coverage. The lack of a yellow fever treatment, as well as the need for drugs that can control emerging viruses, highlights the importance in the discovery of new antivirals. The goal of this work was the discovery of antiviral candidates with the yellow fever virus RNA dependent RNA polymerase as target. In order to achieve this goal, the production of the recombinant form of this enzyme as well as two RNA strand elongation assays were standardized and evaluated for inhibitor screening. The first used modified nucleotides coupled to an alkaline phosphatase reaction, while in the second, protein activity was measured with the intercalating dye SYBR Green I. The SGI assay was used for the screening and evaluation of inhibitors, since it had a higher fluorescence intensity and easier implementation in medium scale experiments. Afterwards, we screened the compound library Pandemic Response Box and identified 25 compounds as RdRp inhibitors. Several compounds had potency within the nano molar range, showing potential existence of false-positives in the screening. The molecules were validated with an SGI interference assay and 18 compounds significantly interfered with the dye. Among the inhibitors considered reliable, Clofazimine, TTP-8307 and MMV218827 had potency within 0.2 to 4 micromolar. Despite the high potency of MMV218827 (IC50 = 0.2 μM), the compound was disregarded as a promising candidate after destabilizing the RdRp in thermal shift assays and because it belongs to a class of compounds that shows nonspecific inhibition of proteins. Clofazimine (IC50 = 4 μM) and TTP-8307 (IC50 = 4 μM) increased the RdRp stability and have chemical scaffolds new to RdRp inhibitors, expanding the development of new inhibitors for this target. Crystallization assays were also performed; however, it was not possible to obtain suitable crystals. Thus, the results obtained herein show that the SGI elongation assay can be used to screen compounds for the yellow fever virus RdRp, and that Clofazimine as well as TTP-8307 are possible antiviral candidates for this virus. Future studies should evaluate the activity of those compounds in cell-based assays