Reduktion der Ischämie-Reperfusions-induzierten leukozytären Entzündungsreaktion durch Maslinsäure

Ischämie und Reperfusion (I/R) induzieren eine entzündliche Gewebereaktion. Diese führt zu einer verstärkten Leukozyten-Endothelzellinteraktion im Mikrogefäßsystem, die durch verschiedene Schritte (Rollen der Leukozyten entlang des Endothels, Adhärenz und Transmigration der Leukozyten über die endotheliale Barriere hinweg in das entzündete Gewebe) gekennzeichnet ist. Verantwortlich sind Hypoxie-induzierte Signalwege. Sie regulieren Transkription und Expression endothelialer Adhäsionsproteine in Endothelzellen und Perizyten. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, ob die Phytosubstanz Maslinsäure (MA) diese zellulären Mechanismen und dadurch die Leukozyten-Endothelzellinteraktion im I/R- Modell reduzieren kann. Die Untersuchung erfolgte in zwei Abschnitten. Im ersten Abschnitt wurden die Auswirkungen der MA auf Endothelzellen und Perizyten unter Bedingungen der Hypoxie und Reoxygenierung (H/R) in vitro untersucht. Im zweiten Abschnitt wurde der Effekt von MA auf die Leukozyten-Endothelzellinteraktion im Tiermodell unter I/R-Bedingungen analysiert. Mitochondriale Aktivität und Zellviabilität MA-inkubierter Endothelzellen und Perizyten wurden durch einen Water-solube tetrazolium (WST)-1 Assay, einen Laktat Dehydrogenase (LDH) Assay sowie einen Annexin V/Propidiumiodid (PI) Assay untersucht. Die Wirkung von MA auf die H/R-induzierte Expression von E-Selektin, intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 und vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 wurde durchflusszytometrisch quantifiziert. Mittels Immunfluoreszenzmikroskopie und Western Blot Analyse erfolgte die subzelluläre Lokalisation von p65, einem wichtigen Bestandteil des nuclear factor kappa B (NFκB)-Signalweges. Die Leukozyten-Endothelzellinteraktion unter I/R-induzierter Entzündung wurde in MA- sowie Vehikel-behandelten Balb/c Mäusen untersucht. Als Modell wurde die Rückenhautkammer (RHK) verwendet. Die Quantifizierung der Leukozyten-Endothelzellinteraktion erfolgte mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie (IFM) und Immunhistochemie. MA beeinflusste die Zellviabilität in vitro nicht. Hingegen wurde durch MA die mitochondriale Aktivität in Endothelzellen und Perizyten signifikant reduziert. Durch ihre inhibitorische Wirkung auf den NFκB-Signalweg supprimierte MA den Expressionsanstieg endothelialer Adhäsionsproteine auf Endothelzellen und Perizyten. In vivo bestätigte sich in post- ischämischem Gewebe MA-behandelter Mäuse eine signifikante Reduktion adhärenter und transmigrierter Leukozyten im Vergleich zu Vehikel-behandelten Mäusen. Zusätzlich konnte MA durch ihr antioxidatives Potential Zellen vor reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) schützen. Immunhistochemisch zeigten Gewebeproben MA-behandelter Mäuse in der 8-Hydroxydesoxyguanosin (OHdG)-Färbung deutlich weniger 8-OHdG-positive Zellen. Dies zeigt, dass der oxidative DNA-Schaden in MA-behandelten im Vergleich zu Vehikel- behandelten Mäusen geringer ist. Zusammenfassend kann MA durch ihren inhibitorischen Einfluss auf den NFκB-Signalweg die Hypoxie-induzierte Expression endothelialer Adhäsionsproteine signifikant vermindern. Entsprechend bewirkt MA in vivo eine signifikante Reduktion der I/R-induzierten Leukozyten- Endothelzellinteraktion sowie der Leukozytentransmigration. Daher könnte MA ein attraktiver Therapieansatz zur Verhinderung des I/R-Schadens darstellen.Ischemia and Reperfusion (I/R) induces an inflammatory tissue reaction. It causes increased microvascular rolling, adherence and transmigration of leukocytes. These steps are mediated by hypoxia-triggered signaling pathways, which upregulate the expression of adhesion molecules on endothelial cells and pericytes. The present study analyzed, whether the phytochemical maslinic acid (MA) is capable of reducing the leukocyte-endothelial cell interaction after I/R. For this purpose, cell viability and mitochondrial activity of MA-exposed endothelial cells and pericytes were assessed by water- soluble tetrazolium (WST)-1 and lactate dehydrogenase (LDH) assays as well as Annexin V/propidium iodide (PI) stainings. The effects of MA on hypoxia and reoxygenation (H/R)- induced expression of E-selectin, intercellular adhesion molecule (ICAM)-1 and vascular cell adhesion molecule (VCAM)-1 were determined by flow cytometry. The subcellular localization of the nuclear factor kappa B (NFκB) subunit p65 was analyzed by immunofluorescence microscopy and Western blotting. In vivo, mouse dorsal skinfold chambers were prepared to assess the effect of MA on I/R-induced leukocytic inflammation. The analysis was made by intravital fluorescence microscopy (IFM) and immunohistochemistry. The results demonstrate that MA did not affect viability but suppressed the mitochondrial activity of endothelial cells and pericytes. Furthermore, MA reduced adhesion molecule expression on endothelial cells and pericytes. This was due to an inhibitory action on NFκB signaling. In vivo, MA significantly reduced the numbers of adherent and transmigrated leukocytes in post-ischemic tissue when compared to vehicle-treated controls. In addition, MA decreased the number of 8-oxodeoxyguanosine (OHdG)-positive cells in the skinfold chamber tissue, indicating that MA inhibits reactive oxygen species (ROS) formation, which are responsible for oxidative DNA damage. In conclusion, MA is capable of decreasing hypoxia-induced expression of endothelial adhesion proteins by inhibition of the NFκB-pathway. Further, MA diminishes the number of adherent and transmigrated leukocytes in vivo after I/R. Hence, MA may represent an attractive compound for the development of a novel therapeutic approach against I/R-induced inflammation