Nanopore fonctionnalisé pour la détection de protéines

The specific detection of proteins is a major challenge in many biotechnological fields such as biomedical diagnostics or fundamental understanding complex protein interactions. Solid-state nanopores are microfabricated nanoscale apertures in thin dielectric membranes that have raised attention as label-free single-molecule biosensors with high sensitivity. A voltage is applied across the membrane, which drives biomolecules through the nanopore. When the analyte crosses the nanopore, it causes a current blockage for a certain time that provides a specific electrical signature for each molecule of interest. During this thesis, a cleanroom process flow has been developed for the fabrication of nanopore chips as well as the drilling of 15 nm diameter nanopore in a 20 nm thick silicon nitride membrane using a Transmission Electron Microscope. The experimental bench for nanopore sensing has been built up and tested. α-thrombin, ɣ-thrombin (5 nm diameter globular proteins) and prothrombin (5 nm x 9 nm oblate spheroid) are three closely-related proteins involved in blood coagulation cascade. They have been sensed using a bare nanopore down to 1 nM concentration, and prothrombin could be discriminated thanks to its bigger size. In order to discriminate α-thrombin from ɣ-thrombin, which have similar sizes, the nanopore’s surface has been chemically functionalized with aptamers. Aptamers are short single stranded DNA sequences selected for their affinity towards a specific biomolecule. We used an aptamer specifically recognizing α-thrombin. We demonstrated that the nanopore functionalization was successful thanks to a measured diameter reduction of the nanopore. Moreover, α-thrombin and ɣ-thrombin present different electrostatic interactions with the functionalization surface of the nanopore, hence a different dwell-time signature in the pore and could be discriminated. Aptamer-functionalized nanopores provide promising and versatile biosensing performances.La détection spécifique de protéines est un enjeu majeur dans de nombreux domaines biotechnologiques tels que le diagnostic biomédical ou la compréhension fondamentale des mécanismes d’interaction entre protéines. Les nanopores solides sont des ouvertures de taille nanométriques micro-fabriqués dans des membranes diélectriques fines. Ils sont prometteurs en tant que biocapteurs sensibles pour la détection sans marquages de molécules uniques. Une tension est appliquée de part et d’autre de la membrane, ce qui entraine les biomolécules au travers du pore. Lorsque l’une d’entre elles traverse le nanopore, elle génère un blocage de courant pendant un certain temps, ce qui offre une signature spécifique pour chaque biomolécule d’intérêt. Durant ces travaux de thèse, un procédé en salle blanche a été développé afin de fabriquer des puces avec nanopore. Une autre technique a été d’utiliser un microscope à transmission électronique pour percer des nanopores de 15 nm de diamètre dans des membranes de nitrure de silicium de 20 nm d’épaisseur. Un banc expérimental pour la détection par nanopore a été construit et testé. α-thrombine, ɣ-thrombine (protéines globulaires de 5 nm de diamètre) et prothrombine (sphéroïde de dimensions 5 nm x 9 nm) sont trois protéines de structures proches impliquées dans la coagulation sanguine. Elles ont été détectées avec un nanopore à une concentration de 1 nM. De plus, prothrombine a été discriminée de α-thrombine et ɣ-thrombine grâce à sa plus grande taille. A cause de leur taille similaire et donc de la même signature de blocage de courant qu’elles génèrent, α-thrombine et ɣ-thrombine n’ont pas été discriminée dans ce pore. La surface du nanopore a donc été fonctionnalisée avec des aptamères. Les aptamères sont de courtes séquences d’ADN simple brin capables de se lier avec une grande affinité à des biomolécules. Nous avons choisi un aptamère reconnaissant spécifiquement α-thrombine. La fonctionnalisation a été prouvée grâce à une réduction mesurée du diamètre du nanopore. α-thrombine et ɣ-thrombine ont des interactions électrostatiques différentes l’une et l’autre avec les aptamères en surface. Nous avons donc pu observer des temps de passage différents dans le nanopore fonctionnalisé entre ces deux protéines et avons pu les discriminer. Les nanopores fonctionnalisés avec aptamères offrent donc des performances prometteuses et polyvalentes en matière de bio-détection