Study of regulation of branched-chain amino acid biosynthesis in C.glutamicum and construction of valine producing strain

L-valine is an essential amino acid with a great medical and industoial importance and the need for efficient bacterial producersof this amino acid is increasing. Corynebacteriumglutamicum is a suitable organism for construction of such productionstrainsandthusbiosynthesisofvaline and expressionofgenes involved in its pathway are intensively studed. In this PhD. thesis, analysis of regulationand modulationof expressionwas carriedout with: (l) genes,which code for common enzymesof all branched-chainamino acids; (2) genes,whose products are involved in the competing biosynthesis pathways of L-isoleucine and L-leucine; and (3) the genethatdeterminesthe key enzyme in the catabolism of pyruvate. Results were used for construction of C. glutamicum production shains with deregulatedbiosynthesisof valine, restrictedbiosynthesisof isoleucine and leucine and optimum distributionof intermediatesof valine. The production strains were manipulated via modification of promoters in the chromosome. Promoters of the ilvA, leuA, ilvD, ilvE, and aceE genes were modified by site-directedmutagenesisof their -10 regions. All these alterationsincreased production of valine by the modified strains. Introduction of weak P-ilvA and P-leuA promotersinto the C. glutamicumchromosomeresultedin an intrinsic lowJevel biosynthesisof...Souhrn L-valin je esenciáIníaminokyselin4 kteú má vellcý význam v medicíně a průmyslu. Proto stale roste potřeba účinnéhobakteriálního producenta této aminokyseliny. Druh Corynebacterium glutamiczzr je vhodným organismem pro konstrukci takovéhoprodukěního kmene a biosyntézavalinu i exprese genů zučastněnýchvjeho biosyntetické drrázejsou tudížintenzivně studovany. V této disertačnípráci byla provedena analýza regulace a modulace exprose genů"které: (1) kódují enzymy společnépro biosyntézuvšech tří větvených aminokyselin; (2) determinujíreakce v konkurenčníchbiosynteticlcých drahách L.isoleucinu a L- leucinu; a (3) genu, kteý kóduje klíčoý enzym katabolismupyruvátu.Výsledky byly využiý pro konstrukci produkčníchhnenů C. glutamicum s deregulovanou biosyntézou valinu, omezenou biosyntézou isoleucinu a leucinu a s optimáIní distribucí intermediátůvalinu. Produkčníkmeny byly manipulovany modifikací promotonl v chÍomosomu.Promotory gen.ůilvA, leuA, ilvD, ilvE a ace:E by|y modifikovfury místně-specifickoumutagenezíjejich oblastí -10. Všechny ýto změny zvýšily u mutantrích kmenůprodukci valinu. Zavedeni slabých promotorů P.ilvA a P.leuA do chromosomu C' glutamicum zpttsobilo sníženíbiosyntézy isoleucinu nebo leucinu a niíslednoubradytrofii na tyto aminokyseliny, která je ýhodnější neŽ auxotrofie navozsná...Department of Genetics and MicrobiologyKatedra genetiky a mikrobiologiePřírodovědecká fakultaFaculty of Scienc