Next generation sequencing in clinical virology: method optimization and it's use for samples with unknown infectious agent

V této diplomové práci bylo testováno použití sekvenátoru MinION (Oxford Nanopore) na vzorcích připravených tak, aby simulovaly infekční vzorky. Testovaný postup má simulovat práci se vzorkem s neznámým patogenem, proto byl také vybrán metagenomický přístup. Byly testovány tři kity: Rapid Barcoding Sequencing, PCR Barcoding a Premium whole genome amplification, které se lišily v délce a náročnosti přípravy a způsobu amplifikace nukleových kyselin. Pro testování bylo vybráno celkem osm virů s různými délkami a různým typem genomu (5,6 - 152 kb, ss/ds RNA, dsDNA), ze kterých bylo připraveno 10 vzorků simulující různé infekce (respirační, gastrointestinálního traktu a moči) a jeden vzorek obsahoval pouze vodu, jako negativní kontrolu. Před přípravou vzorků kity od firmy Oxford Nanopore byly vzorky ošetřeny DNázou a RNázou, virová RNA byla náhodně přepsána do DNA a u některých vzorků byla provedena amplifikace k dosažení větší koncentrace nukleových kyselin. Přípravou Rapid Barcoding Sequencing kit byly detekovány všechny použité viry s největším počtem virových čtení, celkem 4403, o délce 100-250 nt a s dobrým pokrytím virového genomu. PCR Barcoding kitem bylo detekováno pět z osmi virů a počet identifikovaných virových čtení s délekou 100-200 nt výrazně poklesl. Pomocí Premium whole genome...The use of the MinION sequencer (Oxford Nanopore) was tested on samples prepared to simulate infectious samples. The tested procedure is to simulate work with a sample with an unknown pathogen. Therefore, a metagenomic approach was chosen. Three kits were tested: Rapid Barcoding Sequencing, PCR Barcoding and Premium whole genome amplification. Each kit differed in duration, difficulty to prepare and in amplification of nucleic acids. In total it was chosen eight viruses with different genome lengths and with varying types of the genome (5,6 - 152 kb, ss/ds RNA, dsDNA). Ten samples were prepared to simulate different types of infection (respiratory, gastrointestinal tract and urine), and one sample contained pure water as a negative control. Before preparation of the library with Oxford Nanopore's kits, DNase/RNase treatment was used. The viral RNA was transcribed into DNA and in chosen samples were amplificated to reach a higher concentration of nucleic acids. Rapid barcoding sequencing kit detected all selected viruses with the highest number of viral reads (4403) with a length between 100 and 250 nt and quality coverage of viral genomes. PCR Barcoding kit detected five out of eight viruses, and the number of identified reads with a length of 100-200 nt distinctly decreased. Premium whole genome...Department of Genetics and MicrobiologyKatedra genetiky a mikrobiologieFaculty of SciencePřírodovědecká fakult