On the substrate specificity mechanisms of the synthetic and editing sites of isoleucyl-tRNA synthetase

Izoleucil-tRNA-sintetaza (IleRS) u sintetskom mjestu katalizira nastajanje Ile-tRNAIle za biosintezu proteina. IleRS može pogrešno aminoacilirati i strukturno, odnosno kemijski, slične nepripadne aminokiseline poput valina i norvalina što je toksično za stanicu. Kako bi popravila vlastitu pogrešku, IleRS hidrolizira misaminoaciliranu tRNAIle u zasebnom, korektivnom mjestu. U sklopu ove disertacije različitim kinetičkim metodama, uz široki spektar nepripadnih aminokiselina, istražena je enzimska specifičnost sintetskog i korektivnog mjesta IleRS. Sintetsko mjesto je uspješno diskriminiralo većinu testiranih aminokiselina u skladu s njegovom visokom specifičnošću. No, iako je frekvencija nastajanja misaminoaciliranih tRNA uz testirane aminokiseline bila izuzetno mala, sve misaminoacilirane tRNAIle bile su dobri supstrati korektivnog mjesta. Dakle, suprotno od sintetskog, korektivno mjesto pokazuje široku supstratnu specifičnost. Istovremeno, korektivno mjesto pokazuje visoku specifičnost u sprečavanju hidrolize pripadne Ile-tRNAIle, što sugerira da je mehanizam negativne selekcije usmjeravao evoluciju tog mjesta. Dodatna istraživanja su pokazala jedinstvene osobine popravka pogreške kod IleRS u odnosu na njegove najbliže evolucijske srodnike.Isoleucyl-tRNA synthetase (IleRS) whitin its synthetic site pairs isoleucine and tRNAIle for the ribosomal protein syntesis. IleRS can also misaminoacylate tRNAIle with structurally and chemically similar non-cognate valine and norvaline, which is toxic for the cell. To clear the errors, IleRS hydrolyzes misaminoacylated tRNAIles at the dedicated editing site. Here we used a broad spectrum of non-cognate amino acids to explore the mechanisms by which IleRS’ synthetic and editing sites exercise substrate specificity. We found that most of herein tested amino acids were efficiently discriminated at the synthetic site in agrement with its known high specificity. Nevertheless, despite the low misaminocylation frequencies, all misaminocylated tRNAIles were rapidly hydrolyzed at the editing site. Thus, opposite to the synthetic site, the editing site exhibits broad substrate specificity. At the same time, the editing site displays high specificity against the cognate Ile-tRNAIle hydrolysis, indicating that negative selection directed evolution of the editing site