Utjecaj cirkadijalne modulacije na oksidativni status Drosophile melanogaster

Circadian rhythm is present in almost all living organisms due to the rotation of the Earth and regular light and dark changes. Its role is evident in 24 hour modulation of biological processes such as the sleep/wake cycle. Disrupted circadian rhythm correlates with oxidative stress, which is caused by increased production of Reactive Oxygen Species (ROS). In this thesis, we explored the connection between the circadian rhythm and oxidative state in D. melanogaster. Based on similarity in the responsiveness to volatilized cocaine between flies with mutation in timeless gene and wild type flies, we were interested to see whether these similarities will be paralleled in their redox regulation. An indicator of redox state was the concentration of the oxidative metabolism byproduct H2O2 in head homogenates. For detection of H2O2 we used the dihydroethidium (DHE) staining. Furthermore, we wanted to determine if H2O2 production is regulated by circadian rhythm. Measurements were conducted in flies raised in conditions of 12 hours of light-12 hours of dark (LD) and in conditions of constant dark (DD). We determined that H2O2 production was regulated by circadian rhythm for wt flies. However, H2O2 production in DD conditions was increased overall. In tim mutants there was an indication of circadian regulation of H2O2 production in LD conditions but the rhythm was abolished in DD conditions. wt and tim flies differed significantly in the 24 hour modulation of H2O2 in DD, but less so in LD. Further studies are needed to elucidate the role of tim in the regulation of H2O2 amount and the connection with cocaine responsiveness. Taken together, our data suggest that redox status is regulated in a circadian fashion and that a functional tim gene is essential for maintaining circadian rhythmicity.Cirkadijalni ritam je prisutan u skoro svim organizmima. Nastao je kao posljedica rotacije Zemlje i izmjene dana i noći. Važan je za regulaciju brojnih bioloških procesa kao što je i ciklus spavanja. Narušeni cirkadijalni ritam je često povezivan s pojavom oksidativnog stresa koji nastaje kao posljedica povišene produkcije reaktivnih kisikovih vrsta (ROS). U ovome radu, istražili smo povezanost cirkadijalnog ritma i oksidativnog statusa u D.melanogaster. S obzirom da su wild type i timeless mušice pokazale sličnost u odgovoru na izlaganje volatiliziranom kokainu, zanimalo nas je hoće li sličnost biti prisutna i kod regulacije redoksa. Indikator redoks statusa je bila koncentracija H2O2 u homogenatima glava mušica. H2O2 je nusprodukt oksidativnog metabolizma, a za njegovu detekciju korištena je DHE metoda bojanja. Nadalje, ispitali smo je li proizvodnja H2O2 regulirana cirkadijalnim ritmom. Mjerenja su provedena na mušicama koje su držane u LD ili DD uvjetima. Pokazali smo da je kod wt mušica H2O2 proizvodnja regulirana cirkadijalnim ritmom. Međutim, proizvodnja H2O2 je bila sveukupno povišena u DD uvjetima. Kod tim mutanata, indikacije cirkadijalne modulacije u proizvodnji H2O2 prisutne u LD uvjetima nisu uočene i u DD uvjetima. wt i tim mušice se značajno razlikuju u modulaciji H2O2 koncentracija u DD uvjetima dok je u LD uvjetima razlika značajno manja. Potrebno je još studija koje će odrediti točnu ulogu tim gena u regulaciji H2O2 i koje će definirati njegovu ulogu u procesu odgovora na izlaganje kokainu. Sveukupno, dobiveni podatci sugeriraju da je metabolizam ROS-a povezan s cirkadijalnim ritmom te da je funkcionalni gen tim esencijalan za održavanje cirkadijalne ritmičnosti