Zeolite structures as cancer-targeted drug delivery carriers

Tese de Doutoramento em Ciências (Especialidade em Química)Cancer is one of the major health problems worldwide, counting thousands of new cases and deaths annually. The current modalities for cancer treatment include surgery, chemotherapy, radiotherapy and immunotherapy. However, occasionally some of these modalities cannot be used due to the stage of the tumor or have insufficient effect in tumor regression, whereby new therapy strategies are needed. The application of nanotechnology in cancer treatment opened the opportunity to develop new strategies, and drug delivery systems (DDS) can be found among them. The use of DDS has been reported in several studies as a promising approach for delivering drugs to the place of action and reduce the drawbacks of conventional drug administration. To develop these systems, biocompatible and non-toxic materials are needed, where the selected drug can be loaded. Among the several materials that could be used for DDS preparation, are zeolites. The main objective of this work was the development of effective DDS based on zeolites to be used in breast and colorectal cancer treatment. Thus, several structures and their potential as carriers were investigated, as well as the mechanisms underlying zeolite internalization, exploring surface functionalization on zeolite toxicity and uptake by human cells and exploring the use of zeolites as magnetic resonance imaging agents. The potential of the use of the anti-inflammatory drug salicylic acid, for breast cancer treatment, loaded into silica microporous and mesoporous structures, was assessed. It was observed that mesoporous structures had higher drug loading capacity than microporous structures. In terms of cytotoxicity, only DDS prepared with mesoporous structures were able to decrease cell growth. Overall, the results indicated the potential of salicylic acid for cancer treatment when loaded into mesoporous structures, but not when loaded into microporous structures. So, in order to study the potential of the microporous structures as host for DDS, an anticancer drug was used. Then, three different zeolites (NaY, NaA and ZSM5) and one titanosilicate (ETS-10) were investigated as carriers for the anticancer drug 5-fluorouracil (5-FU) in order to select the most promising zeolite structures for further studies. The results showed the biocompatibility of these microporous structures since they were not toxic to colon or breast cancer cells. In addition, loading 5-FU in these structures led to potentiation of 5-FU and allowed the selection of two zeolites, NaY and LTL for the next studies. To finalize the exploration of the potential of zeolite for DDS preparation, DDS were prepared, and their in vitro and in vivo efficacy were assessed. Results of the in vitro studies confirmed the potential of the DDS prepared with NaY and LTL (Zeo L) for breast, colorectal and melanoma cancers treatment since there was a significant inhibition of cell growth when cells are treated with the DDS, with potentiation of 5-FU effect compared to the free drug. However, in vivo studies using the chick embryo chorioallantoic membrane as model (CAM) revealed that DDS induced a reduction in tumor perimeter for breast cancer cells, while no reduction was detected for colon tumors, under the used concentration of DDS. Zeolite NaY magnetization revealed its potential as magnetic resonance imaging agent, opening new opportunities to prepare hybrid systems combining the encapsulating and delivery properties of the zeolites and the magnetic properties of biocompatible magnetite nanoparticles. Considering the scarce studies on the internalization mechanisms of zeolite nanoparticles, the endocytic mechanisms involved in their internalization by human cells were explored. The results showed that zeolite internalization is likely mediated by caveolin-dependent endocytosis and it is also dependent on microtubule polymerization pathways. In these studies, the uptake of zeolite nanoparticles was assessed in the same cell lines. It was found that cancer cells internalize higher amounts of zeolite nanoparticles and at a faster rate than normal cells. The effect of zeolite surface functionalization plays also an important role in the cellular uptake. Based on the observations from these studies, it was possible to observe that positively-charged zeolite nanoparticles present higher uptake rates than negatively-charged zeolite nanoparticles. This work provides a valuable contribution to the use of zeolites as carriers for DDS preparation and presents novel evidences about the biological mechanisms enrolled in the uptake of zeolite nanoparticles by human cells. Thus, the work performed in this thesis is not an end of a research project, but an important contribution to a better design of DDS based on zeolitic structures, opening new horizons for the application of these DDS in cancer treatment.O cancro constitui um dos maiores problemas de saúde no mundo, contando anualmente com milhares de novos casos e mortes. As atuais abordagens de tratamento do cancro incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia e imunoterapia. Contudo, por vezes algumas não podem ser utilizadas devido à fase avançada do tumor ou por apresentarem pouco efeito na regressão do mesmo, pelo que são necessárias novas abordagens terapêuticas. A aplicação da nanotecnologia no tratamento do cancro, abriu a oportunidade de desenvolver novas estratégias, contando-se entre estas os sistemas de libertação de fármacos. Vários estudos têm reportado o uso destes sistemas como uma abordagem promissora para a entrega de fármacos no local de ação e na redução dos efeitos secundários associados aos sistemas de administração convencionais. Para o desenvolvimento de sistemas de libertação de fármacos, são necessários materiais biocompatíveis e não tóxicos onde o fármaco possa ser inserido. Entre o grande número de materiais que podem ser usados para a preparação destes sistemas, encontram-se os zeólitos. O principal objetivo deste trabalho foi desenvolver sistemas de libertação de fármacos baseados em zeólitos para o tratamento do cancro colorretal e da mama. Assim, foram exploradas várias estruturas e avaliado o seu potencial como transportadores de fármacos, bem como os mecanismos subjacentes à internalização das partículas de zeólitos por células humanas tumorais. Foi também avaliado o efeito da funcionalização da superfície na toxicidade e internalização das nanopartículas nas células e explorado o uso de zeólitos como agentes para imagem de ressonância magnética (MRI). Foi avaliado o potencial do uso do anti-inflamatório ácido salicílico para o tratamento do cancro da mama quando encapsulado em estruturas de sílica micro- e mesoporosas. Observou-se que as estruturas mesoporosas apresentavam maior capacidade de encapsulamento do fármaco do que as estruturas microporosas. Em termos de citotoxicidade, apenas os sistemas de libertação de fármacos preparados com estruturas mesoporosas foram capazes de reduzir o crescimento celular. No geral, os resultados indicaram o potencial do ácido salicílico para o tratamento do cancro quando encapsulado em estruturas mesoporosas, mas não quando encapsulado em estruturas microporosas. Assim, para estudar o potencial do uso das estruturas microporosas como material para a preparação de sistemas de libertação, foi utilizado um fármaco antineoplásico. Neste contexto, três zeólitos diferentes (NaY, NaA e ZSM5) e um titanosilicato (ETS-10) foram explorados como suportes para o fármaco antineoplásico 5-fluorouracilo (5-FU), de forma a selecionar as estruturas mais promissoras para os estudos seguintes. Os resultados demonstraram que estes materiais são biocompatíveis, uma vez que não se revelaram tóxicos para células do cancro colorretal e mama. Além disso, o encapsulamento do 5-FU nestas estruturas, levou a uma potenciação do seu efeito. Este estudo permitiu a seleção de duas estruturas zeolíticas, NaY e LTL, para os estudos subsequentes. Para finalizar a exploração do potencial dos zeólitos para a preparação de sistemas de libertação de fármacos, foram preparados sistemas usando os zeólitos NaY e L, e a sua eficácia in vitro e in vivo foi avaliada. Os resultados dos estudos in vitro confirmaram o potencial dos sistemas de libertação preparados com os zeólitos NaY e LTL (Zeo L) no tratamento do cancro da mama, colorretal e melanoma, uma vez que se verificou uma inibição significativa do crescimento celular quando as células foram tratadas com os sistemas. Verificou-se ainda uma potenciação do 5-FU quando comparado com o fármaco livre. Contudo, os estudos in vivo usando o modelo membrana corioalantóide de embrião de galinha (CAM), mostraram que, na concentração usada, os DDS induziram a redução dos tumores da linha Hs 578T, mas não dos tumores da linha RKO. A magnetização do zeólito NaY revelou o seu potencial como agente para MRI, abrindo novas oportunidades para a preparação de sistemas híbridos que combinem as propriedades de encapsulação e libertação dos zeólitos e, as propriedades das nanopartículas magnéticas. Uma vez que há poucos estudos sobre os mecanismos de internalização das nanopartículas de zeólitos, foram também estudados os mecanismos envolvidos na sua internalização em células humanas. Os resultados mostraram que a internalização dos zeólitos é principalmente mediada pela endocitose dependente da caveolina, sendo também dependente das vias envolvidas na polimerização dos microtúbulos. Nestes estudos, verificou-se ainda a internalização dos zeólitos em células humanas e observou-se que as células cancerígenas internalizam maior quantidade de zeólito a uma taxa mais rápida do que as células normais. Concluiu-se também que o efeito da funcionalização da superfície dos zeólitos desempenha um papel importante na internalização celular. Os resultados obtidos mostraram que nanopartículas de zeólitos positivamente carregadas têm maior capacidade de internalização do que partículas negativamente carregadas. Em suma, este trabalho fornece uma contribuição importante sobre o uso de zeólitos para a preparação de sistemas de libertação controlada de fármacos e apresenta novas evidências sobre os mecanismos biológicos envolvidos na internalização dos zeólitos em células humanas. Assim, o trabalho desenvolvido nesta tese poderá contribuir para o desenvolvimento de melhores sistemas de libertação de fármacos baseados em estruturas zeolíticas, abrindo novos horizontes para a sua aplicação no tratamento do cancro.The research work here presented was financially supported by an individual fellowship (SFRH/BD/97797/2013) and by the strategic fundings of Centre of Chemistry (UID/QUI/00686/2013 and UID/QUI/0686/2016) and ICVS/3B’s (POCI-01-0145-FEDER-007038) from the Fundação para Ciência e Tecnologia (FCT) and European Regional Development Fund (FEDER) funds, through the Competitiveness Factors Operational Programme (COMPETE). The projects: NORTE-01-0145-FEDER-000013 and BioTecNorte (operation NORTE-01-0145-FEDER-000004), from Northern Portugal Regional Operational Programme (NORTE 2020), under the Portugal 2020 Partnership Agreement, were also sponsoring this work. Part of this work was also partially supported by the NORTE 2020 and the FEDER under the Grant NORTE-45-2015-02, and by European Union's Horizon 2020 research and innovation programme under grant agreement Nº 686009