Instabilité génétique : des déviations du contenu génomique à la plasticité d’expression des gènes

Most animal cells are diploid, containing two copies of each chromosome. Establishment of proper bipolar mitotic spindle containing two centrosomes, one at each pole contributes to accurate chromosome segregation. This is essential for the maintenance of genome stability, tissue and organism homeostasis. However, numerical deviations to the diploid set are observed in healthy tissues. Polyploidy is the doubling of the whole chromosome set and aneuploidy concerns the gain or loss of whole chromosomes. Importantly, whole genome duplications and aneuploidy have also been associated to pathological conditions. For example, variations to genome content are associated with chromosome instability and cancer development, however their exact contribution to cancer genome remains poorly understood.In the first part of my PhD project, I investigated the consequences of polyploidy during cell division. I found that the presence of extra DNA and extra centrosomes generated invariably multipolar spindles. Then I identified contributors to the multipolar status using in vivo approaches in Drosophila neural stem cells and in vitro culture of cancer cells. Further I combined DNA and spindle perturbations with computer modelling and found that in polyploid cells, the presence of excessive DNA acts as a physical barrier blocking spindle pole coalescence and bipolarity. Indeed, laser ablation to disrupt and increase in microtubule stability and length to bypass the DNA-barrier could rescue bipolar spindle formation. This discovery challenges the current view that suggested extra-centrosomes as only contributor to spindle multipolarity and provides a rational to understand chromosome instability typical of polyploid cells.The aim of the second part of my PhD project was to generate a novel tool to quantitively probe chromosome loss in vivo in Drosophila tissues. Aneuploidy has been observed in various physiological tissues, however the frequency of this error remained highly debatable. In addition, tools developed so far to assess aneuploidy lack a temporal dimension. To circumvent this, I used the expression of a GFP report gene driven by the GAL4/UAS system and its inhibition by GAL80. In principle, the random loss of the chromosome carrying the GAL80 sequence leads to GFP appearance in aneuploid cells that can therefore be followed in live tissues. I found that chromosome loss was extremely infrequent in most tissues of the wild type fly. This tool combined with fluorescent marker and/or tested in various genetic background, might help understanding mechanisms behind aneuploidy genesis and outcome in vivo.While developing this tool, I discovered that in the larval brain, GFP cells where not a by-product of chromosome loss but rather an unexpected mis-regulation in the expression of the GAL80 gene. These results have strong implications for the Drosophila community as it can result in false positive in clonal experiments. Further, I discovered a mosaicism and plasticity of the Drosophila brain in neural stem cells for gene expression which differs from other organs and that is influenced by environmental stimuli. This possibly reflects a certain level of plasticity in the brain necessary for neuronal diversity, adaptation and survival.La plupart de nos cellules sont diploïdes possédant deux copies de chaque chromosome. Lors de la mitose, la formation d’un fuseau bipolaire avec un centrosome à chaque pôle permet la ségrégation correcte des chromosomes, essentiel au maintien de la stabilité génétique. Il existe néanmoins des variations du contenu chromosomique comme la polyploïdie, définit comme le doublement de l’ensemble des chromosomes et l’aneuploïdie, définie comme la perte ou le gain de chromosome entier. Bien qu’observées, la fréquence des cellules aneuploïdies dans les tissus d’un organisme sain reste controversée.De façon importante, la duplication du génome et l’aneuploïdie sont associées à des pathologies et sont considérées comme une caractéristique du cancer. En effet, un nombre anormal de chromosomes est souvent associé à une instabilité chromosomique. Toutefois le rôle et les implications de ces variations dans l’initiation et la progression de tumeur restent peu compris.J’ai d’abord étudié les conséquences de la polyploïdie sur la division des cellules. J’ai utilisé des approches in vivo et in vitro en induisant la polyploidisation par défaut de cytocinèse dans des cellules souches neurales de drosophile et des cellules cancéreuses humaines. L’analyse de leur mitose m’a permis de découvrir que la présence de chromosomes et de centrosomes en excès conduisait invariablement à la formation de fuseaux multipolaires. En modélisant les cellules polyploïdes, j’ai découvert qu’au-delà de la quantité, la conformation spatiale de l’ADN contribue à cette multipolarité. Des perturbations expérimentales au niveau de l’ADN et du fuseau m’ont permis de démontrer que la présence d’ADN en excès agit comme une barrière physique bloquant la coalescence des multiples pôles et par conséquent empêchant la bipolarité. De façon intéressante, j’ai réussi à restaurer la bipolarité en supprimant la « barrière d’ADN » par ablation avec laser ou en augmentant la longueur des microtubules pour contourner celle-ci. Alors que l’amplification centrosomale était considérée comme unique acteur, mes résultats identifient l’excès d’ADN comme contributeur clef de la multipolarité et de l’instabilité chromosomique typique des cellules polyploïdes.Puis, je me suis ensuite intéressée à l’aneuploïdie, dont la fréquence en contexte sain reste un sujet de débat intense. De plus, les outils développés jusqu’à présent pour évaluer le taux d’aneuploïdie manque d’une dimension temporelle. J’ai donc généré un outil génétique innovant de visualisation et de suivi des cellules aneuploïdes in vivo chez la drosophile. J’ai utilisé l’expression de la GFP comme gène rapporteur, contrôlée par le système GAL4/UAS et son inhibition par GAL80. Ainsi, la perte aléatoire du chromosome contenant la séquence du GAL80 entraine l’apparition d’un signal GFP dans les cellules aneuploïdes. Celles-ci peuvent donc être facilement détectées et suivies en temps-réel dans les tissus. Utilisant ce système, j’ai découvert que la perte de chromosome était un évènement très rare dans les tissus de la mouche. Cet outil combiné à d’autres marqueurs fluorescents et/ou utilisé dans divers contextes génétiques pourrait aider à la compréhension de la genèse et du devenir des cellules aneuploïdes in vivo.De plus, j’ai constaté que le cerveau de la larve présentait un nombre important de cellules GFP. De manière surprenante, ces cellules ne résultaient pas de la perte de chromosomes mais de la perte d’expression du gène GAL80. Ces résultats inattendus ont de fortes implications pour la communauté des drosophilistes car cela peut mener à des faux positifs dans les expériences de génération de clones. J’ai aussi découvert que les cellules souches neurales présentaient un mosaïsme dans l’expression des gènes, qui diffèrent d’autres organes et s’adaptent à des stimuli environnementaux. Ceci représente possiblement un niveau de plasticité dans le cerveau nécessaire à la diversité neuronale, l’adaptation et la survie