Controlling the effect of injection in the hypothalamus of diet induced obese mice

Diet-induced obesity causes a central inflammatory process in the brain, more specifically in the arcuate nucleus of the hypothalamus; in addition to substantially altering cholesterol homeostasis in the brain. The brain is one of the richest organs in cholesterol and cholesterol homeostasis has proved to be very important not only to maintain healthy brain physiology, but also directly influencing the whole-body homeostasis. In addition, several metabolic disorders are correlated with different neurodegenerative diseases. Cholesterol in the brain is converted primarily to 24-hydroxycholesterol (24-OHC) by CYP46A1. Changes in oxysterol metabolism have been correlated with obesity. Previous studies from our laboratory have identified CYP46A1 as a relevant therapeutic target, not only for Machado de Joseph disease, but also for other neurodegenerative diseases. One of these studies revealed that the silencing of the expression of the Cyp46a1 gene (using AAV5-shCyp46A1), in the hypothalamus of C57BL/6J mice fed a low fat diet (Chow) (control diet) and a high fat diet (HFD), had a profound impact on the dysregulation of the entire physiological process of body homeostasis. In this sense, additional studies became necessary to demonstrate that the effect of silencing the Cyp46a1 gene in the arcuate nucleus was specific, discarding the effect of the surgical procedure or viral vectors administration. Thus, in this study, our main objective was to control the effect of Cyp46a1 silencing on the hypothalamus (arcuate nucleus). For this, through stereotaxic surgery, a control gene (GFP) was delivered by AAV vectors in the arcuate nucleus; both in animals fed with Chow ration and those fed with HFD ration. The project's main hypothesis is that the GFP protein does not interfere in the physiology of the hypothalamus and consequently in the metabolism of the whole-body, regardless of diet. Our data confirm that stereotaxic surgery and GFP expression did not alter the homeostasis of the hypothalamus and, consequently, there was no change in the whole-body metabolism of the mice.A epidemia do excesso de peso e obesidade representa um dos mais importantes problemas de saúde pública do século XXI. A obesidade induzida por dieta causa um processo inflamatório central no cérebro, mais especificamente no núcleo arqueado do hipotálamo. O núcleo arqueado é uma região especial do cérebro responsável pela regulação da homeostasia energética corporal, possuindo uma importância crucial na manutenção do equilíbrio entre consumo e gasto energético. Na obesidade há disfunção hipotalâmica e esta disfunção pode alterar substancialmente a homeostasia do colesterol no cérebro. O cérebro é um dos órgãos mais ricos em colesterol e a sua homeostasia do colesterol é muito importante para manter a fisiologia cerebral saudável e também influencia diretamente a homeostasia do resto do organismo. Além disso, o facto de os distúrbios metabólicos estarem correlacionados com diferentes doenças neurodegenerativas, como: doença de alzheimer, doença de Parkinson e doença de Huntington. O colesterol no cérebro é convertido principalmente em 24S-hidroxicolesterol pela enzima Cyp46a1. Alterações no metabolismo do oxisterol foram correlacionadas com a obesidade. Estudos do nosso laboratório identificaram o CYP46A1 como um alvo terapêutico relevante, não apenas para a doença Machado de Joseph, mas também para outras doenças neurodegenerativas. Um desses estudos, revelou que o silenciamento da expressão do gene Cyp46a1 (utilizando-se AAV5-shCyp46A1), no hipotálamo (núcleo arqueado), de morganhos C57BL/6J alimentados com dieta com baixo teor de gordura (Chow – low fat control diet) (dieta controlo) e com uma dieta com alto teor de gordura (HFD – high fat diet), tem impacto profundo na desregulação de todo o processo fisiológico da homeostasia corporal destes ratinhos. Tem ainda grande impacto no perfil fisiológico dos órgãos metabólicos e alterações na morfologia estrutural de cada um deles, como: WAT, BAT, fígado, pâncreas, entre outros. Desta forma, os resultados deste estudo sugerem que o silenciamento do Cyp46a1 nos animais Chow AAV5-shCyp46a1 e HFD AAV-shCyp46a1 resulta em um fenótipo de obesidade, alterações nos níveis de oxisteróis cerebrais e diabetes mellitus tipo 2; além de modificações significativas no comportamento. Os resultados sugerem o papel importante do gene Cyp46a1 na manutenção do metabolismo do colesterol no cérebro e no controlo da homeostasia energética corporal. Diante destas observações, estudos adicionais tornaram-se necessários para comprovar o efeito do silenciamento do gene Cyp46a1 no núcleo arqueado, descartando o efeito do procedimento cirúrgico. Desta forma, neste estudo, o nosso principal objetivo foi controlar o efeito do silenciamento de Cyp46a1 no hipotálamo (núcleo arqueado). Para tal, por meio de cirurgia estereotáxica foi realizada a injeção de um gene controlo (GFP) mediado por vetores AAV no núcleo arqueado; tanto em morganhos alimentados com dieta Chow, como em morganhos alimentados com dieta HFD. A hipótese do projeto é que a proteína GFP não interfere na fisiologia do hipotálamo e consequentemente no metabolismo de todo o corpo, independentemente da dieta. Este estudo foi conduzido durante um período de 12 semanas; no início do estudo os morganhos (C57BL/6J) foram divididos aleatoriamente em dois grupos: Chow (controlo) e HFD. A partir deste momento, cada grupo foi alimentado com a dieta específica por 12 semanas. Na quarta semana do estudo, os dois grupos foram submetidos a injeção estereotáxica bilateral no núcleo arqueado. Os resultados demonstraram que a proteína GFP não interferiu na fisiologia do hipotálamo (núcleo arqueado) e que as injeções estereotáxicas (AAVGFP) não causaram inflamação comprometedora que tenha alterado a fisiologia e o fenótipo alcançado através exclusivamente da dieta administrada (Chow e HFD) aos grupos dos morganhos utilizados. O fenótipo obeso foi previsivelmente alcançado pela indução de dieta gordurosa apenas nos morganhos HFD, assim como, a alteração da morfologia de vários tecidos metabólicos (WAT, BAT, pâncreas e fígado) e houve uma grande acumulação de lípidos nos órgãos. Os morganhos controlo (dieta Chow) não desenvolveram obesidade, não apresentaram alterações na morfologia dos tecidos metabólicos (WAT, BAT, pâncreas e fígado) e também não apresentaram modificações no acúmulo lipídico dos órgãos. Como este estudo é um controlo importante para o projeto de silenciamento do gene Cyp46a1 realizado anteriormente, os resultados aqui apresentados confirmam que a cirurgia estereotáxica e a expressão de GFP não alteram a homeostasia do hipotálamo e consequentemente não há alteração no metabolismo corporal dos morganhos