Polysaccharides from Finnish fungal resources

Mushrooms are the second largest edible biomass available from Finnish forests. Their main components are non-digestible polysaccharides such as β-glucans, mannans, and galactans. These molecules have been shown to possess a large variety of biological activities. These activities are determined by their physicochemical properties, like sugar composition, glycosidic linkage and molecular weight, which are significantly influenced by the fungal species and extraction methods. Currently, the low collection of natural basidiomycete production leaves the edible mushroom biomass largely unused. Development of β-glucan-oriented isolation and purification schemes can increase the value of Finnish mushrooms, meeting the rapidly growing international market for functional foods and nutraceuticals. Usually, β-glucans are extracted from fungi with hot water. Higher yield and purity of these molecules can be achieved by pre-treatments and harsher extracting conditions. For a complete understanding of influence of processing parameters on composition and properties of polysaccharides, thorough characterization of molecular properties of the obtained polysaccharides is also required. Seasonal variation, slow growth and logistic problems might hamper the mushroom industry. Currently, two strategies are studied to overcome these issues: cultivation of fungal mycelium in liquid medium (submerged cultivation) or on solid substrate (solid-state cultivation). The produced biomasses can be readily used as source of fungal polysaccharides. Submerged cultivation is further favored by low cost and fast production. Moreover, the use of lignocellulosic, such as agricultural sidestreams, and liquid, such as oils, supplements to the medium has been shown to increase mycelial yield. The aim of the current work was to extract polysaccharides from Finnish fungal resource and determine their yield and properties utilizing colorimetric, chromatographic, and spectroscopic techniques. The cultivated Agaricus bisporus, wild Craterellus tubaeformis, and rare and slow-growing Inonotus obliquus were investigated as polysaccharide resource. The effects of a pretreatment with ethanol-hydrochloric acid mixture, prior to sequential hot water extractions, were investigated using A. bisporus. Cell wall polysaccharides were extracted from C. tubaeformis with a sequential protocol of increasing harshness using hot water and alkaline solutions of different concentrat. Cultivated mycelium of I. obliquus was considered as an alternative of the sterile conk, commonly known as Chaga, produced by this species as polysaccharide source. Sea buckthorn (Hippophaë rhamnoides) berry press cake, a fibrous side stream with high oil content, was supplemented to the submerged cultivation medium of I. obliquus. Exopolysaccharides (EPS) from culture media and intracellular polysaccharides (IPS) extracted from mycelia were investigated. Moreover, the potential of the birch heart rot, resulted from infection by this species, as polysaccharide source has been assessed in this work for the first time. Polysaccharides from wild sterile conk, cultivated mycelium, and heart rot were extracted, characterized, and compared. The pretreatment with acid and the use of alkali during the extraction resulted in disruption of the cell wall, which facilitated the solvent access to its deeper layers. The harsher methods increased extraction yields and the β-glucan contents in the extracts, while decreasing the molecular weight of the polysaccharides. In case of C. tubaeformis, hot water was an inefficient extraction medium for β-glucans. Structural investigation assigned to these polymers a backbone of →6)-β-Glc-(1→ units with short and frequent branches in O-3 position. The thermal stability of fungal polysaccharides was drastically reduced only after strong alkali extraction. Supplementation with press cake increased the cultivation yield of I. obliquus. The supplementation positively affected the yield and molecular weight of EPS. However, at higher dosages, the supplementation reduced content and the molecular weight of IPS. The pectins in the sea buckthorn press cake affected to small extent the monomer composition of both IPS and EPS. The polysaccharides extracted from cultivated mycelium showed high abundance of glycogen, absence of phenolic compounds, and polydispersed polymer populations, while the opposite was observed for sterile conk polysaccharides. Structurally similar β-glucan was identified in sterile conk and mycelium extracts. On the other hand, heart rot polysaccharides were mainly composed of hemicelluloses. However, fungal polysaccharides were identified as well, particularly in the hot water extract, showing potential also for the birch leftover after sterile conk harvesting. The results of the present doctoral thesis offer valuable information for the exploitation of Finnish fungal species as sources of bioactive polysaccharide (in particular β-glucan) aimed to the nutraceutical market. Moreover, this thesis could be a starting point for more in-depth studies on the effect of liquid culture supplementation on the macromolecular properties of mycelial polysaccharides.Sienet ovat Suomen metsien toiseksi suurin syötävä biomassa. Niiden pääkomponentit ovat sulamattomia polysakkarideja, kuten β-glukaaneja, mannaaneja ja galaktaaneja. Näillä molekyyleillä on osoitettu olevan laaja valikoima biologisia aktiivisuuksia. Nämä toiminnot määräytyvät niiden fysikaaliskemiallisten ominaisuuksien, kuten sokerikoostumuksen, glykosidisidosten ja molekyylipainon perusteella, joihin sienilajit ja uuttomenetelmät vaikuttavat merkittävästi. Suurin osa syötävien sienten biomassasta jää tällä hetkellä käyttämättä, koska kantasieniä ei kerätä riittävästi. Suomalaisten sienien arvoa voi lisätä β-glukaanipohjaisten eristämis- ja puhdistusjärjestelmien kehittäminen, jolloin voidaan tuottaa raaka-aineita nopeasti kasvaville kansainvälisille funktionaalisten elintarvikkeiden ja ravintoaineiden markkinoille. Yleensä β-glukaanit uutetaan sienistä kuumalla vedellä. Esikäsittelyillä ja ankarammilla uutto-olosuhteilla voidaan saavuttaa näiden molekyylien suurempi saanto ja puhtaus. Jotta ymmärrettäisiin täysin käsittelyparametrien vaikutus polysakkaridien koostumukseen ja ominaisuuksiin, vaaditaan myös saatujen polysakkaridien molekulaaristen ominaisuuksien perusteellista karakterisointia. Kausivaihtelut, hidas kasvu ja logistiikkaongelmat saattavat haitata sieniteollisuutta. Tällä hetkellä tutkitaan kahta strategiaa näiden ongelmien ratkaisemiseksi: sienirihman viljely nestemäisessä väliaineessa (upotusviljely) tai kiinteällä alustalla (solid state-viljely). Tuotettua biomassaa voidaan helposti käyttää sienipolysakkaridien lähteenä. Upotettua viljelyä suosivat lisäksi edulliset kustannukset ja nopea tuotanto. Lisäksi lignoselluloosaa sisältävien maatalouden sivuvirtojen, ja nesteiden, kuten öljyjen, käyttö kasvatusalustan ravintolisänä on osoittanut lisäävän sienirihmaston satoa. Tämän työn tavoitteena oli uuttaa polysakkarideja suomalaisista sieniresursseista ja määrittää niiden saanto ja ominaisuudet käyttämällä kolorimetrisiä, kromatografisia ja spektroskooppisia tekniikoita. Polysakkaridien lähteenä tutkittiin viljeltyä Agaricus bisporusta (herkkusieni), villiä Craterellus tubaeformista (suppilovahvero) ja harvinaista ja hitaasti kasvavaa Inonotus obliquusta (pakurikääpä). Esikäsittelyn vaikutuksia etanoli-suolahapposeoksella ennen peräkkäisiä kuumavesiuuttoja tutkittiin käyttämällä A. bisporusta. Soluseinän polysakkarideja uutettiin C. tubaeformista menetelmällä, jonka voimakkuutta lisättiin käyttämällä peräkkäin kuumaa vettä ja eri konsentraation emäksisiä liuoksia. I. obliquusin viljeltyä rihmastoa pidettiin vaihtoehtoisena polysakkaridilähteenä steriilille kasvustolle, joka tunnetaan yleisesti nimellä pakuri. Tyrnin (Hippophaë rhamnoides) -marjapuristuskakulla, joka on kuitumainen sivuvirta ja jolla on korkea öljypitoisuus, täydennettiin I. obliquusin nestemäistä kasvatusainetta. Kasvatusaineen eksopolysakkarideja (EPS) ja sienirihmastosta uutettuja solunsisäisiä polysakkarideja (IPS) tutkittiin. Lisäksi tämän lajin tartunnasta syntyvän koivun ydinlahon potentiaali polysakkaridien lähteenä on arvioitu tässä työssä ensimmäistä kertaa. Luonnonvaraisen steriilin kasvuston, viljellyn sienirihmaston ja ydinlahon polysakkarideja uutettiin, karakterisoitiin ja niiden koostumusta vertailtiin. Esikäsittely hapolla ja emäksen käyttö uuton aikana johti soluseinän hajoamiseen, mikä helpotti liuottimen pääsyä sen syvempiin kerroksiin. Rajummat menetelmät lisäsivät uuton saantoa ja uutteiden β-glukaanipitoisuutta samalla kun polysakkaridien molekyylipaino pieneni. Kuuma vesi oli tehotonta β-glukaanin uuttamiseksi C. tubaeformista. Rakenteellinen tutkimus osoitti näiden polymeerien koostuvan →6)-β-Glc-(1→ -yksiköistä, joilla on lyhyet ja usein esiintyvät haarat O-3-asemassa. Sienipolysakkaridien lämpövakaus heikkeni jyrkästi vasta voimakkaan alkaliuuton jälkeen. Tyrnin puristekakku lisäsi I. obliquusin kasvua viljelyssä. Täydennys vaikutti positiivisesti EPS:n saantoon ja molekyylipainoon. Kuitenkin suuremmilla annoksilla lisäravinteet pienensivät IPS:n pitoisuutta ja molekyylipainoa. Puristekakun pektiinit vaikuttivat hieman sekä IPS:n että EPS:n monomeerikoostumukseen. Viljellystä sienirihmastosta uutetuissa polysakkarideissa esiintyi runsaasti glykogeenia, mutta ei fenolisia yhdisteitä ja polymeeripopulaatiot olivat polydispergoituneita, kun taas steriilin kasvuston polysakkarideilla havaittiin päinvastainen. Rakenteellisesti samankaltaista β-glukaania tunnistettiin steriilistä kasvustosta ja sienirihmastouutteista. Toisaalta sydänlahon polysakkaridit koostuivat pääasiassa hemiselluloosista. Kuitenkin myös sienipolysakkarideja tunnistettiin, etenkin kuumavesiuutteessa, mikä osoittaa potentiaalia myös koivujätteille steriilin kasvuston keräämisen jälkeen