Clonagem e expressão de proteínas recombinantes humanas envolvidas em processos imunes

A expressão de proteínas recombinantes, em escala laboratorial, tem sido uma das aplicações mais visíveis da biotecnologia. A expressão heteróloga de proteínas depende da tecnologia do DNA recombinante, que, por meio da manipulação do material genético, permite a obtenção de quase todas as proteínas nas quantidades desejadas. Esta tese sobre clonagem e expressão de proteínas recombinantes humanas envolvidas em processos imunes apresenta o trabalho desenvolvido para clonar e expressar o Receptor 3 de Citotoxicidade Natural humano (NCR3), uma proteína de superfície expressa por células Natural Killer, um dos braços do sistema imunológico inato. Outro objetivo foi expressar também o ligante natural do NCR3, NCR3 Ligante 1 (NCR3LG1). Essas duas proteínas estão envolvidas na ativação da resposta inata do sistema imunológico contra proteínas tumorais que expressam NCR3LG1. Uma estratégia tradicional de amplificação por PCR baseada em primers foi utilizada para amplificar as regiões a serem clonadas dos genes de interesse de plasmídeos comerciais e cloná-los no vetor pET28a(+) para a expressão controlada das proteínas, com tag His6, por lac mediada pelo promotor T7 em células Escherichia coli BL21(DE3) Hi-ControlTM. O hNCR3 foi expresso com sucesso por indução com IPTG e foi recuperado dos corpúsculos de inclusão por purificação com refolding de proteína em coluna. O hNCR3LG1 foi expresso usando condições semelhantes, e foi recuperado do conteúdo celular por cromatografia de afinidade simples à base de níquel. Verificou-se que as proteínas produzidas estabelecem um complexo de 1: 1 in vitro, conforme determinado por uma abordagem simples de eletroforese em gel nativo, mantendo assim a funcionalidade desejada.Recombinant protein expression, at a laboratory scale, has been one of the most visible applications of biotechnology. Protein heterologous expression depends on recombinant DNA technology, that, by manipulating the genetic material, allows obtaining almost any protein is the desired amounts. This thesis on cloning and expression of human recombinant proteins involved in immune processes presents the work developed to clone and express the human Natural Cytotoxicity Receptor 3 (NCR3), a surface protein expressed by Natural Killer cells, one of the arms of the innate immune system. Another goal was also to express NCR3's natural ligand, NCR3 Ligand 1 (NCR3LG1). These two proteins are involved in activating the immune system innate response against NCR3LG1-expressing tumoral proteins. A traditional primer-based PCR amplification strategy was employed to amplify the regions to be cloned of the genes of interest from commercial plasmids and clone them into the pET28a(+) vector for T7 promoter-mediated lac-controlled expression of His6 tag-fused proteins in Escherichia coli BL21(DE3) Hi-Control TM cells. hNCR3 was successfully expressed by IPTG-induction and was recovered from purification bodies by on column- protein refolding. hNCR3LG1 was expressed using similar conditions and was recovered from cell contents by nickel-based simple affinity chromatography. The produced proteins were found to establish a 1:1 complex in vitro, as determined by a simple native gel electrophoresis approach, thus retaining the desired functionality