Bioburden in aquafeeds designed for echinoderms production in Portugal

Mestrado em Análise e Controlo de Riscos Ambientais para a SaúdeABSTRACT - The aquafeeds can be a route of contamination for animals produced in aquaculture and, consequently, for humans. For this reason, it is imperative to identify the bioburden present in aquafeeds, in order to know the threat that may represent for human health. Extruded and jellified pellets and frozen microalgae were specifically designed for the potential production, in Recirculating Aquaculture Systems, of two species of echinoderms, the sea cucumber Holothuria tubulosa and the sea urchin Paracentrotus lividus. Thus, diet samples were collected to characterize their bioburden. Furthermore, water samples and sponge filter samples were also collected to identify their proliferation to water and the efficiency of the filtration process used, respectively. All samples were collected 90 days after the start of the experiment. Culture-based methods were used for the characterization of bioburden, in which mesophilic bacteria and total coliforms were enumerating for bacterial evaluation, while filamentous and xerophilic fungi were counting and identifying through micro and macroscopic characteristics for fungal assessment. Aspergillus sections were investigated through molecular method Real-Time Polymerase Chain Reaction. Mycotoxin analysis was carried out utilizing a Liquid Chromatography-Mass Spectrometry system. For mesophilic bacteria, the results reveal some spoilage activity. The results for total coliforms were actually minimal. Fusarium verticillioides were identified in one jellified pellet and in one frozen microalgae and F. culmorum was identified in the same frozen microalgae. Aspergillus sections were not detected in any sample. Mycotoxins were detected in the extruded pellets and in one jellified pellet, but the quantification only was possible in the extruded pellets. However, most parts of the findings of this study were below the limits defined as harmless. So the diets used in the production systems evaluated seem to be safe to be used for feeding the studied echinoderms.RESUMO - As dietas utilizadas em aquacultura podem ser uma fonte de contaminação para as espécies produzidas e, sendo estas, na maioria das vezes, destinadas ao consumo humano, poderão efetivamente representar uma ameaça para a saúde humana. Portugal tem uma costa muito extensa, o que propicia que os hábitos alimentares da população Portuguesa sejam, em grande parte, sustentados pela atividade pesqueira, sendo, portanto, um dos países com maior consumo de pescado em todo o mundo. Os peixes e o marisco apresentam uma elevada qualidade nutricional, tanto ao nível do conteúdo proteico como lipídico, o que também suscita a sua procura como parte integrante de uma alimentação saudável. Assim, para que esses hábitos alimentares saudáveis sejam mantidos, de uma forma sustentável para o meio ambiente, e com o intuito de combater o declínio que se tem verificado nos stocks naturais decorrentes das pescas, surge a aquacultura, que visa garantir a produção das espécies aquáticas, sobretudo para o consumo humano. A produção de novas espécies, como os ouriços-do-mar e os pepinos-do-mar, também tem sido investigada, tanto em relação à manutenção da sua qualidade nutricional, através de dietas especificamente formuladas, como relativamente à sua aceitação em termos de aspeto visual e palatabilidade para consumo. Esta parece ser também uma excelente alternativa a determinadas espécies-alvo, cuja abundância se encontra ameaçada, sendo necessário continuar a investigar a sua aceitação perante a população. Uma alimentação ideal para as espécies produzidas em aquacultura seria, de facto, o mais semelhante possível ao que se encontra disponível nos ecossistemas aquáticos, garantindo as suas necessidades nutricionais e a sua qualidade. No entanto, o grande aumento do esforço pesqueiro que se tem verificado nos últimos anos sugere a procura de outros ingredientes, igualmente nutritivos, que possam substituir a farinha e o óleo de peixe, até então utilizados de forma mais abundante. Deste modo, tem-se recorrido à utilização de cereais, produzidos na agricultura, por serem uma excelente fonte de proteína com potencial para a resolução deste recente problema. Para além disso, é também uma mais-valia na produção de ração, uma vez que permite uma melhor coesão dos ingredientes e, ainda, reduz o seu teor de humidade. Isto possibilita uma menor desagregação da ração quando esta é empregue no meio aquático, minimizando a difusão de matéria orgânica no sistema de produção e, portanto, preservando a qualidade da água. Contudo, os cereais são uma fonte preocupante de microrganismos, pois, durante o seu crescimento nas culturas, estão expostos a danos provocados por insetos, ou por ação mecânica de máquinas, e a variações climáticas que promovem temperaturas e teores de humidade propícios ao desenvolvimento de bactérias e de fungos. As bactérias desenvolvem-se muito rapidamente, quando em condições ideais e podem produzir toxinas, podendo originar várias doenças. Porém, a sua presença em dietas formuladas para alimentar espécies produzidas em aquacultura não tem sido alvo de investigação, o que incitou o interesse e a curiosidade relativamente à abordagem da contaminação bacteriana neste estudo. Os fungos, por sua vez, produzem micotoxinas, que são muito prejudiciais para a saúde animal e humana. Estas acarretam uma grande preocupação, devido ao facto de apresentarem muita estabilidade perante o calor, não sendo, portanto, eliminadas em processos de extrusão de alimento utilizados para produzir as rações. A acrescentar, ainda, a sua capacidade de persistir nas diferentes matrizes, mesmo após o desaparecimento dos fungos que as produzem, uma vez que estes apresentam uma maior sensibilidade ao processamento de alimentos. Adequadamente, as micotoxinas têm sido alvo de vários estudos em alimentação formulada especificamente para animais produzidos em cativeiro, mas ainda existem poucos estudos direcionados para a investigação da sua presença em dietas destinadas à alimentação utilizada em aquacultura. Tendo tudo isto em consideração, revela-se ser de extrema importância a identificação da contaminação biológica presente nas mais variadas dietas utilizadas em sistemas de produção de aquacultura, cuja atividade encontra-se em progressiva expansão. Assim, este estudo foi desenvolvido como forma de contribuir para um maior conhecimento científico, relativamente ao potencial risco de contaminação biológica a que as espécies produzidas em aquacultura podem, eventualmente, estar a ser expostas, através da utilização das formulações de dietas ricas em variedade de cereais. Este estudo focou-se, portanto, na caracterização da contaminação biológica presente em diferentes formulações de dietas, de modo a verificar a sua qualidade microbiológica. Para tal, foi realizada a amostragem de dietas secas, semi-húmidas e microalgas congeladas, que foram especificamente projetadas para a potencial produção de pepinos-do-mar Holothuria tubulosa e de ouriços-do-mar Paracentrotus lividus, em aquacultura com sistemas de recirculação. Além de serem recolhidas amostras de dietas, também foram recolhidas amostras de água dos tanques de produção, para uma melhor compreensão sobre a proliferação da contaminação nas diferentes matrizes, uma vez que a água é um excelente meio de ligação entre os microrganismos e as espécies de cultura. E, ainda, foram recolhidas amostras de filtros de esponja, de modo a validar a eficiência da sua utilização nestes sistemas de produção. A amostragem de dietas, águas e filtros de esponja ocorreu 90 dias após o início dos ensaios de produção dos referidos equinodermes. A contaminação bacteriana foi investigada através da enumeração de bactérias mesófilas, que permitem estimar o nível de deterioração presente nas dietas, e de coliformes totais, cuja presença revela a falta de cuidados de higiene durante o processamento das dietas. Para o crescimento de bactérias mesófilas, utilizou-se o meio de cultura Agar Triptona de Soja com o antifúngico Nistatina, a 30 °C, e, para os coliformes totais, foi utilizado o meio de cultura Agar Bílis Vermelho Violeta, a 35 °C, que foram submetidos às condições referidas durante 7 dias. Em relação à micobiota, esta foi avaliada através da enumeração e identificação de fungos e da análise de micotoxinas. Para o crescimento de fungos filamentosos, utilizou-se o meio de cultura Agar Extrato de Malte com o antibiótico Cloranfenicol e, para os fungos xerófilos, foi utilizado o meio de cultura Agar Dicloran-Glicerol, ambos foram armazenados a 27 °C, durante 7 dias. Após o período de crescimento, as espécies fúngicas foram contadas e identificadas através das suas características micro e macroscópicas. Para a deteção das secções de Aspergillus foi utilizado o método molecular Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real. A análise de micotoxinas foi realizada através de Cromatografia Líquida acoplada à Espetrometria de Massa. Relativamente à contaminação por bactérias mesófilas, foram detetadas na maioria das amostras analisadas, sugerindo que, de um modo geral, o seu conteúdo em grãos cereais e o teor de humidade nas dietas tenham sido fatores decisivos, assim como as possíveis flutuações de temperatura durante o transporte das dietas. Os resultados para os coliformes totais foram efetivamente mínimos, apenas uma dieta seca estava contaminada, o que se pressupõe ser proveniente dos grãos de cereais utilizados na sua formulação; e também foram detetados numa dieta congelada, presumindo-se que esta contaminação tenha ocorrido durante a amostragem ou o processamento de amostras. Fusarium verticillioides foi identificado numa dieta semi-húmida, que continha milho na sua composição, e numa dieta congelada e F. culmorum foi identificado na mesma dieta congelada. As secções de Aspergillus não foram detetadas em nenhuma amostra. As micotoxinas foram detetadas nas dietas secas analisadas, que continham maior teor de cereais na sua composição, e numa dieta semi-húmida, mas apenas foi possível a sua quantificação nas dietas secas. Os resultados obtidos neste estudo, na sua maioria, encontravam-se abaixo dos limites estabelecidos. Deste modo, as dietas utilizadas nos sistemas de produção avaliados parecem ser seguras como parte integrante da alimentação dos equinodermes dos respetivos ensaios, sugerindo que não são prejudiciais para a saúde dessas espécies nem colocam em risco a Saúde Pública.N/