Cloning and biochemical characterization of light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase (LPOR) isoforms in sunflower Helianthus annuus

Redukcja protochlorofilidu jest kluczową reakcją w szlaku biosyntezy chlorofilu. Przeprowadza ją enzym zależna od światła oksydoreduktaza protochlorofilidu (LPOR). Enzym ten może występować w roślinach w postaci jednej lub kilku izoform. Dotychczas jedynym organizmem z opisanymi trzema izoformami LPOR była roślina modelowa Arabidopsis thaliana. Celem niniejszej pracy było sklonowanie, produkcja, oczyszczenie i charakterystyka trzech izoform LPOR: HaPOR1, HaPOR2, HaPOR3 występujących w słoneczniku zwyczajnym (Helianthus annuus) oraz zaproponowanie parametru opisującego wiązanie NADPH przez te enzymy. Zbadany został proces tworzenia się aktywnego kompleksu LPOR w zależności od stężenia NADPH w obecności i bez lipidów. Określono wpływ tych czynników na aktywność enzymu i widma emisji fluorescencji barwnika. Wykazano, że spośród izoform słonecznika zwyczajnego najwięcej aktywnych kompleksów przy niskim stężeniu NADPH tworzy izoforma HaPOR2, niezależnie od obecności lipidów. Najwyższego stężenia NADPH do stworzenia aktywnych kompleksów potrzebuje natomiast izoforma HaPOR1.The reduction of protochlorophyllide is a key reaction of the chlorophyll biosynthesis pathway. It is carried out by the light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase (LPOR). One or several isoforms of the enzyme can exist in plants but until now, the model plant Arabidopsis thaliana was the only organism with thoroughly examined three LPOR isoforms. The aim of this study was to clone, produce, purify and characterize three LPOR isoforms of sunflower (Helianthus annuus): HaPOR1, HaPOR2, HaPOR3, and to propose a parameter describing the binding of NADPH by LPOR. The process of the formation of the active LPOR complex was investigated in the relation to the concentration of NADPH, both in the presence and absence of lipids. The influence of these factors on the activity of the enzyme and the fluorescence emission spectra of the protochlorophyllide were determined. It has been shown that among the sunflower isoforms, HaPOR2 isoform forms the most active complexes at low NADPH concentrations, regardless of the presence of lipids. The isoform HaPOR1 needs the highest concentration of NADPH to form active complexes