Influence of oxygen concentration on the activity of DNA repair pathways in pluripotent stem cells

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (ang. induced Pluripotent Stem Cells; iPSCs), z uwagi na swe unikatowe właściwości: zdolność do samoodnowy oraz różnicowania w kierunku komórek ekto-, mezo- i endodermy, mają wiele potencjalnych zastosowań. Wyzwaniem wciąż jednak pozostaje utrzymanie stabilności genetycznej iPSCs w warunkach hodowli in vitro, co ściśle związane jest z aktywnością szlaków naprawy DNA, zwłaszcza dwuniciowych pęknięć DNA (ang. Double-Strand DNA Break; DSB). Podstawowe szlaki zaangażowane w naprawę DSBs to precyzyjna rekombinacja homologiczna (ang. Homologous recombination; HR) oraz podatne na błędy niehomologiczne łączenie końców (ang. Non-homologous end-joining; NHEJ).Czynniki, które wpływają na zachowanie komórek w hodowli in vitro to m.in., stężenie O2 i temperatura. Celem niniejszej pracy było zbadanie wpływu niedotlenienia – hipoksji (5% O2), a także obniżonej temperatury – hipotermii (32⁰C) i zmian stężenia O2 (21% --> 5% i 5% --> 21% O2), na aktywność mechanizmów naprawczych DSBs w ludzkich iPSCs. W celu kompleksowej analizy, posłużono się metodami Western blot oraz RT-qPCR, które pozwoliły zbadać regulację mechanizmów naprawczych na poziomie aktywności białek oraz transkryptów. Analizę przeprowadzono po 2 i 8 godz. od zakończenia indukcji DSBs, do której wykorzystano bleomycynę.W pracy wykazano, że etapy odpowiedzi na uszkodzenie DNA, takie jak detekcja oraz przekaz sygnału, podlegają regulacji na poziomie fosforylacji białek, m.in. ATM, H2A.X, CHK1/2, P53. W hipoksji aktywność ATM, P53 oraz CHK1 była niższa niż w normoksji, natomiast w hipotermii podwyższony poziom fosforylowanych białek utrzymywał się najdłużej. W badaniach nie wykazano istotnego wpływu niedotlenienia ani temperatury na poziomy białek ze szlaków HR (RAD51, P-BRCA1) i NHEJ (Ku80, XLF), co świadczy o ich równoległym zaangażowaniu w procesy naprawcze w ludzkich iPSCs. Jednak co ważne, spośród badanych warunków środowiskowych, w hipoksji wykazano najniższy poziom transkryptu PUMA, wskazującego na aktywację apoptozy. Może to świadczyć o efektywniejszej naprawie DSBs w tych warunkach. Łącznie, otrzymane wyniki dowodzą, że stężenie O2 oraz temperatura, nie mają wpływu na wybór szlaku naprawy między HR i NHEJ w ludzkich iPSCs. Jednak mają one wpływ na aktywność białek sensorycznych oraz przekazujących sygnał na drodze odpowiedzi na DSBs, a także na ścieżki zatrzymania cyklu komórkowego i apoptozy.Induced pluripotent stem cells (iPSCs), due to their unique properties: the ability to self-renew and to differentiate into ecto-, meso- and endoderm, offer many potential applications. However, the maintenance of the genetic stability of iPSCs in in vitro culture still remains a challenge, and is closely related to the activity of DNA repair pathways, particularly double-strand DNA breaks (DSBs). The main pathways involved in the repair of DSBs are homologous recombination (HR) and non-homologous end-joining (NHEJ).One of the major factors that can affect the behavior of cells in in vitro culture, is oxygen concentration and temperature. The aim of this study was to investigate the effect of hypoxia (5% O2), as well as reduced temperature — hypothermia (32⁰C) and alterations in O2 concentration (21% --> 5% and 5% --> 21% O2), on the activity of DSBs repair mechanisms in human iPSCs. For a comprehensive analysis, the Western blot and RT-qPCR methods were used. They allowed to study the regulation of repair mechanisms at the level of proteins activity and transcripts. The analysis was performed 2 and 8 hours after induction DSBs with bleomycin.Studies have shown that the stages of DNA damage response, such as signal detection and transduction, are regulated at the level of protein phosphorylation, for example H2A.X, ATM, CHK1/2, P53. The activity of ATM, P53 and CHK1 was lower in hypoxia than in normoxia, while in hypothermia, the increased level of phosphorylated proteins persisted the longest. The results showed no significant effect of hypoxia or temperature on the levels of proteins involved in HR (RAD51, P-BRCA1) or NHEJ (Ku80, XLF) pathways, which proves their equal involvement in the DNA repair processes in human iPSCs. Importantly, among the environmental conditions tested, the lowest level of PUMA transcript was detected in hypoxia, which indicates the lowest activation of apoptosis. This result may indicate a more effective repair of DSBs under these conditions.To summarize, the obtained results prove that the O2 concentration and temperature influence the level of active sensory and signaling proteins involved in the response to DSBs in hiPSCs, as well as the pathways of cell cycle arrest and apoptosis. However, they do not affect the choice of the repair pathway between HR and NHEJ