Identification and characterization of a HY5-BBX transcriptional module regulating light and karrikin signaling

When a dark grown seedling perceives the full spectrum of light for the first time its developmental program is changed from skotomorphogenic to photomorphogenic growth. This transition is accompanied by massive transcriptomic changes. The bZIP transcription factor ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5) is a major positive regulator of photomorphogenesis. Its protein amount, the surrounding light levels, and degree of photomorphogenic growth, measured by the hypocotyl length, in a developing seedling correlate with each other. While HY5 has the ability to bind one third of all promoters in the Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) genome, the lack of a transactivation domain (TAD) in its protein sequence raises the question how HY5 can regulate the transcription of its numerous potential target genes. In this thesis I identified the B-Box (BBX) proteins BBX20, BBX21, and BBX22 as cofactors of HY5 that are required for HY5 to fulfil its role as a positive regulator of photomorphogenesis. For this purpose, it was shown that the triple mutant bbx202122 genocopies the hy5 mutant under monochromatic light conditions. This is supported by a transcriptome analysis, which showed that most of the BBX-regulated genes are similarly HY5-regulated. Importantly, no additive phenotypes nor transcriptional regulation of target genes were observed in a bbx202122 hy5 mutant. In accordance with a proposed model in which HY5 binds its target promoters and the BBX proteins provide the transcriptional activation ability through their physical interaction with HY5, we could show that the interaction of BBX20 with the target promoters of MYB12 and F3H, as well as its overexpression phenotypes, depend on the presence of HY5. In transient protoplast assays, transcriptional activation of a GUS-reporter under the control of the MYB12 or F3H promoter was only achieved when HY5 was expressed together with either BBX20, BBX21 or BBX22. It was previously observed that a dark stable HY5 protein (HY5ΔN77) could not induce photomorphogenesis when expressed in dark grown Arabidopsis seedlings. In line with these observations, we were able to show that HY5 and BBX21 together induce photomorphogenesis, when expressed under those conditions. This suggests that the molecular basis for the constitutive photomorphogenic 1 (cop1) phenotype is the overaccumulation of HY5 and BBX proteins, which work interdependently to induce photomorphogenesis. In the second part of this thesis, I investigated the role of BBX proteins in karrikin (KAR) signaling. As suggested by the strong transcriptional induction of BBX20 in response to KAR treatment I found evidence that BBX20 and its closest homologue BBX21 are required for the induction of KAR-induced inhibition of hypocotyl elongation and induction of anthocyanin accumulation. Analysis of higher order mutants suggested that BBX20 and BBX21 act downstream of SUPPRESSOR OF MAX2 (SMAX1) and SMAX1-LIKE 2 (SMXL2), which are the main negative regulators of KAR signaling. Whole transcriptome analysis showed that the induction of anthocyanin biosynthesis in smax1 smxl2 is fully dependent on BBX20 and BBX21. In contrast, the regulation of hypocotyl elongation requires other factors which are acting in parallel to the BBX proteins. Furthermore, I provide evidence that in the KAR signaling pathway, HY5 and BBX20 and BBX21 act interdependently to regulate hypocotyl elongation and anthocyanin biosynthesis. The work of this thesis presents a mechanism of how HY5, as a master transcriptional regulator, can gain specificity by interacting with its cofactors BBX20, BBX21 and BBX22 to regulate photomorphogenesis and KAR responses.Wenn ein Keimling zum ersten Mal dem vollen Lichtspektrum ausgesetzt ist, wechselt er vom skotomorphogenetischen zum photomorphogenetischen Wachstum. Dieser Übergang ist von einer tiefgreifenden Reorganisation des Transkriptoms begleitet. Der bZIP Transkriptionsfaktor ELONGATED HYPOCOTYL 5 (HY5) ist ein wichtiger positiver Regulator der Photomorphogenese. HY5s Proteinmenge, die Lichtintensität in der Umgebung und der Grad an Photomorphogenese, gemessen anhand der Hypokotyl-Länge eines sich entwickelnden Keimlings, korrelieren miteinander. HY5 besitzt das Potenzial, ein Drittel aller Promotoren im Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) Genom zu binden. Da HY5 allerdings keine Transaktivierungsdomäne (TAD) besitzt, ist es unklar, wie HY5 die Transkription dieser großen Anzahl an potenziellen Zielgenen reguliert. In dieser Arbeit wurden die B-Box (BBX) Proteine BBX20, BBX21 und BBX22 als Kofaktoren von HY5 identifiziert. Diese sind unerlässlich, damit HY5 seine Rolle als positiver Regulator der Photomorphogenese erfüllen kann. Es wurde gezeigt, dass die Dreifachmutante bbx202122 unter monochromatischen Lichtbedingungen denselben Phänotyp wie eine hy5 Mutante aufweist. Eine Transkriptomanalyse zeigte, dass der Großteil der BBX-regulierten Gene in gleicher Weise HY5-reguliert ist. Insbesondere wurden in der bbx202122 hy5 Mutante keine additiven Phänotypen oder verstärkte transkriptionelle Regulationen der BBX- und HY5-Zielgene beobachtet. Im Einklang mit der Hypothese, dass HY5 an die Promotoren der Zielgene bindet und die BBX Proteine die transkriptionelle Aktivierung durch die direkte Interaktion mit HY5 ermöglichen, wurde gezeigt, dass die Interaktion von BBX20 mit den Zielpromotoren von MYB12 und F3H, sowie die BBX20 Überexpressionsphänotypen von der Anwesenheit von HY5 abhängig sind. In transienten Protoplastenassays wurde ein GUS-Reporter, der unter der Kontrolle des MYB12 oder F3H Promotors stand, nur aktiviert, wenn HY5 zusammen mit BBX20, BBX21 oder BBX22 exprimiert wurde. Eine im Dunkeln stabile Version des HY5 Proteins (HY5ΔN77) induziert keine Photomorphogenese in Arabidopsis Keimlingen, die im Dunkeln gewachsen sind. Werden allerdings HY5 und BBX21 zusammen unter diesen Bedingungen exprimiert, induzieren sie Photomorphogenese. Dies legt nahe, dass die Überakkumulation von HY5 und BBX Proteinen, welche die Photomorphogenese in Abhängigkeit voneinander regulieren, die molekulare Grundlage für den constitutively photomorphogenic 1 (cop1) Phänotyp bilden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle von BBX Proteinen im Karrikin (KAR) Signalweg untersucht. Wie durch die starke transkriptionelle Induktion von BBX20 durch KAR bereits impliziert wurde, wird BBX20 und sein nächstes Homolog BBX21 für die Inhibierung der Hypokotyl-Elongation sowie der Akkumulation von Anthocyanen durch KAR benötigt. Die Analyse von Mehrfachmutanten hat gezeigt, dass BBX20 und BBX21 den beiden Inhibitoren des KAR Signalwegs SUPPRESSOR OF MAX2 (SMAX1) und SMAX1-LIKE 2 (SMXL2), nachgeschaltet sind. Transkriptomanalysen zeigten, dass die Induktion der Anthocyan-Biosynthese in der smax1 smxl2 Doppelmutante vollständig von BBX20 und BBX21 abhängig ist. Im Gegensatz dazu, benötigt die Regulation der Hypokotyl-Elongation weitere Faktoren, die parallel zu den BBX Proteinen im KAR Signalweg wirken. Außerdem wurde gezeigt, dass im KAR Signalweg höchstwahrscheinlich HY5 zusammen mit BBX20 und BBX21 in Abhängigkeit voneinander Hypokotyl-Elongation und Anthocyan-Biosynthese regulieren. Zusammenfassend stellen die Ergebnisse dieser Arbeit einen Mechanismus dar, wie HY5, als ein Master Transkriptionsregulator, Spezifizität durch die Interaktion mit den Kofaktoren BBX20, BBX21 und BBX22 erwerben kann, um Photomorphogenese und KAR Effekte zu regulieren