Regulation und Funktion des Tight Junction-Proteins MarvelD3

Epithelien stellen eine Barriere zwischen dem Organismus und der Außenwelt sowie zwischen verschiedenen Kompartimenten innerhalb eines Organismus dar. Je nach Lokalisation lassen sich unterschiedliche Barriereeigenschaften beobachten. Diese werden maßgeblich von der Beschaffenheit eines Proteinkomplexes zwischen den Epithelzellen, der Tight Junction (TJ) beeinflusst. Die Familie der TJ-assoziierten Marvel-Proteine, bestehend aus Occludin, Tricellulin und MarvelD3, bildet einen wichtigen Bestandteil der TJ. In der Darmschleimhaut von Patient*innen mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) wurde eine veränderte Expression von Occludin und Tricellulin beobachtet. Während Tricellulin direkte Effekte auf der Makromolekülebene hat, wurde bei Occludin eine Mischung aus Barriereeffekten und zellregulatorischen Eigenschaften beobachtet. In Vorversuchen zu dieser Arbeit zeigte sich, dass auch die MarvelD3-Expression durch CED beeinflusst wird. Um herauszuarbeiten, welche Zytokine für die veränderte MarvelD3-Expression verantwortlich sind, wurde die intestinale Zelllinie HT-29/B6 nach der Inkubation mit CED-relevanten Zytokinen auf ihren transepithelialen Widerstand (TER) und ihre MarvelD3-Expression hin untersucht. Um den Einfluss von MarvelD3 auf die epitheliale Barriere weiter zu analysieren, wurden MarvelD3-Überexpressionsklone in Zelllinien mit unterschiedlichen Barriereeigenschaften untersucht. MDCK II-Zellen bilden lecke Epithelien, an denen sich abdichtende Effekte deutlicher zeigen, während MDCK I-Zellen dichte Monolayer ausbilden, welche es ermöglichen, permeabilitätsfördernde Effekte besser zu detektieren. Die manuelle Widerstandsmessung ergab, dass die Inkubation der HT-29/B6-Zellen mit TNFα, TGFβ1, IL-4, IL-13 und IL4+IL-13 eine Senkung des TER zur Folge hatte. In der Western Blot-Analyse zeigte sich die Expression der Isoform 2 von MarvelD3 nach der Inkubation mit IL-4 signifikant und nach der Inkubation mit IL-13 tendenziell erhöht. Die Inkubation mit den übrigen Zytokinen hatte nur andeutungsweise eine Veränderung der MarvelD3-Expression zur Folge. Die Ergebnisse der Messung des TER und der Dilutionspotentiale in der Ussing-Kammer lassen vermuten, dass die Überexpression von MarvelD3 eher unspezifische Effekte auf die Barriere hat. Als limitierender Faktor sind hierbei die geringen Versuchszahlen an den Überexpressionsklonen der Zelllinie MDCK I zu nennen. In der Western Blot-Analyse einer Auswahl weiterer TJ-Proteine in den Überexpressionsklonen zeigte sich in beiden Zelllinien ein verändertes TJ-Protein-expressionsprofil. Zusammenfassend ist davon auszugehen, dass MarvelD3 keinen direkten Einfluss auf die epitheliale Barriere nimmt, sondern eher zellregulatorische Eigenschaften besitzt. Die veränderte MarvelD3-Expression nach der Inkubation mit IL-4 und IL-13 ließe sich gut mit der Beobachtung vereinbaren, dass das Protein vor allem in der Darmschleimhaut von Patient*innen mit Colitis ulcerosa verändert exprimiert wird, muss in zukünftigen Analysen jedoch weiter untersucht werden.Epithelia represent a barrier between the organism and the outside world, as well as between different compartments within an organism. Depending on the localization, different barrier properties can be observed. These are significantly influenced by the properties of the tight junction (TJ). The family of TJ-associated Marvel proteins, consisting of occludin, tricellulin and MarvelD3, forms an important component of the TJ. Altered expression of occludin and tricellulin has been observed in the intestinal mucosa of patients with inflammatory bowel disease (IBD). While tricellulin has direct effects at the macromolecule level, a mixture of barrier effects and cell regulatory properties was observed for occludin. Initial analysis showed that MarvelD3 expression is also affected by IBD. To elaborate which cytokines are responsible for the altered MarvelD3 expression, the intestinal cell line HT-29/B6 was analyzed for its transepithelial resistance (TER) and MarvelD3 expression after incubation with IBD-relevant cytokines. To further investigate the impact of MarvelD3 on the epithelial barrier, overexpression clones in cell lines with different barrier properties were examined. MDCK II cells form a leaky epithelium in which sealing effects can be more clearly demonstrated, whereas MDCK I cells form tight monolayers that allow permeability-promoting effects to be detected better. Transepithelial resistance measurements revealed that incubation of HT-29/B6 cells with TNFα, TGFβ1, IL-4, IL-13 and IL4+IL-13 resulted in a decrease in TER. Western blot analysis showed that the expression of isoform 2 of MarvelD3 was significantly increased after incubation with IL-4, and tended to be increased after incubation with IL-13. The remaining cytokines induced slight or no changes in MarvelD3 expression. The results of measurement of TER and dilution potentials in the Ussing chamber suggest that overexpression of MarvelD3 has rather nonspecific effects on the epithelial barrier. A limiting factor is the low number of experiments conducted with the MDCK I cell line overexpression clones. Western blot analysis of a selection of other tight junction proteins revealed an altered tight junction protein expression profile in the overexpression clones of both cell lines. In conclusion, it can be assumed that MarvelD3 does not directly influence the epithelial barrier but rather has cell regulatory properties. The altered MarvelD3 expression after incubation with IL-4 and IL-13, could be well reconciled with the observation that the protein is expressed in an altered manner in the intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis, but needs to be further investigated in future analyses