Functional characterisation of heterzygous Steroidogenic Factor 1 (SF1/NR5A1) mutations in patients with XY-disorders of sex development

Hintergrund: XY-Störungen der Geschlechtsentwicklung (DSD) sind ein angeborener Zustand mit XY-Karyotyp und atypischem gonadalem oder anatomischem Geschlecht. Der Transkriptionsfaktor Steroidogenetischer Faktor 1 (SF1, Nukleärer Rezeptor Subfamilie 5 Gruppe A Mitglied 1) ist einer der Schlüsselfaktoren der gonadalen und adrenalen Entwicklung sowie Steroidogenese. Bisher wurden über 130 genetische SF1-Varianten mit variablen Phänotypen bei DSD beschrieben wie komplette gonadale Dysgenesie, schwere und milde partielle Gonadendysgenesien, Hypospadien, Infertilität und bilaterale Anorchie. Eine Genotyp-Phänotyp-Korrelation konnte bisher nicht gezeigt werden. Ziel der Studie: Untersuchung einer Genotyp-Phänotyp-Korrelation von natürlich vorkommenden heterozygoten SF1-Punktmutationen mit einem Spektrum an Phänotypen von Hypospadien bis hin zu kompletter gonadaler Dysgenesie durch funktionelle in vitro Studien. Methoden: Analyse der transkriptionellen Aktivität von SF1 Mutationen bei zentralen Promotoren der Geschlechtsentwicklung durch Dual-Glo Luciferase Assays in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK293) und murinen Sertolizellen (TM4). Als Reporter werden der Testis-spezifische SOX9 (SRY-related HMG box containing gene 9) Enhancer TESCO (Core Element of Testis Specific Enhancer of Sox 9), CYP11A1 (Cholesterol Side-chain Cleavage Enzyme) und AMH (Anti-Müller’sches Hormon) verwendet, welche die Geschlechtsdeterminierung und -differenzierung reflektieren. Auch Synergieeffekte mit den bekannten Kofaktoren SOX9 und GATA4 (GATA Bindungsprotein 4) werden untersucht. Ergebnisse: Die SF1 Mutationen p.G35E, p.R62C und p.L376F, welche zu partieller und kompletter Gonadendysgenesie führen, zeigen einen signifikanten Aktivierungsverlust des SOX9 Enhancers TESCO und des CYP11A1-Promoters. Auch weisen sie reduzierte Interaktionseffekte mit dem Kofaktor SOX9 für den SOX9 Enhancer TESCO auf. Außerdem zeigen sie eine leichte Reduktion der transkriptionellen Aktivität für den AMH-Promoter und reduzierte Interaktionseffekte mit dem Kofaktor GATA4. Die SF1 Mutationen p.P131L, p.P191C, welche zu Infertilität führen, zeigen nur einen moderaten Aktivierungsverlust des SOX9 Enhancers TESCO und weisen ebenfalls verringerte Interaktionseffekte mit dem Kofaktor SOX9 auf. Für CYP11A1 zeigen sie eine leicht reduzierte Aktivierung. Die Variante p.A154T mit dem Phäntyp einer Hypospadie zeigt keine funktionelle Einschränkung. Konklusion: Die p.A154T-Variante wird als Einzelnukleotid-Polymorphismus identifiziert. Die transkriptionelle Aktivität der verschiedenen SF1-Mutationen insbesondere auf den SOX9 Enhancer TESCO und CYP11A1-Promoter reflektiert in vitro die Schwere der klinischen gonadalen Dysgenesie und Beeinträchtigung der fetalen Leydigzellfunktion. Der partielle SF1-Funktionsverlust kann für den SOX9 Enhancer TESCO nicht durch den Kofaktor SOX9 ausgeglichen werden. Eine Vorhersage des klinischen Phänotyps aufgrund der Korrelation in der funktionellen Charakterisierung ist jedoch nicht möglich.Background: XY-Disorders of sex development (XY-DSD) are congenital conditions of patients with XY-karyotye in which gonadal or anatomical sex is atypical. The transcription factor Steroidogenic Factor 1 (SF1, Nuclear Receptor Subfamily 5 Group A member 1) is one of the key factors involved in gonadal and adrenal development and steroidogenesis. Until now, over 130 genetic variants of SF1 were described in different phenotypes of XY-DSD such as complete gonadal dysgenesis, severe and mild partial gonadal dysgenesis, hypospadias, infertility and bilateral anorchia. A comprehensive way of genotype-phenotype correlation has not been demonstrated yet. Objective: To investigate genotype-phenotype correlation of naturally occurring heterozygous pointmutations of SF1 with a diverse spectrum of phenotypes from hypospadias to complete gonadal dysgenesis by functional in vitro studies. Method: Investigation of the transcriptional activity of SF1 missense mutations on central promoters of gonadal development by Dual-Glo luciferase assays in human embryonal kidney cells (HEK293) and murine sertoli cells (TM4). As reporters the testis-specific SOX9 (SRY-related HMG box containing gene 9) Enhancer TESCO (Core Element of Testis Specific Enhancer of Sox 9), CYP11A1 (Cholesterol Side-chain Cleavage Enzyme) and AMH (Anti-Mullerian Hormone) reflecting sex determination and differentiation are used. Also synergy effects with known cofactors such as SOX9 and GATA4 (GATA binding protein 4) are investigated. Results: SF1 missense mutations leading to partial and complete gonadal dysgenesis (p.G35E, p.R62C and p.L376F) show a significant reduced ability to activate the SOX9 Enhancer TESCO and the CYP11A1 promoter. They also fail to interact with cofactor SOX9 on the SOX9 Enhancer TESCO. They show minor reduction of transcriptional activity of the AMH promoter and reduced interaction effects with cofactor GATA4. SF1 missense mutations leading to infertility (p.P131L, p.P191C) show only moderate reduced ability to activate TESCO and failed to interact with the cofactor SOX9, for CYP11A1 they show a minor reduced activation. The variant p.A154T with hypospadia has no functional restriction. Conclusion: The variant p.A154T is identified as a single nucleotide polymorphism. The transcriptional activity of the different SF1 mutations especially on the TESCO and CYP11A1 promoter reflect the severity of clinical expression of gonadal dysgenesis and fetal leydigcell function in vitro. There cannot be found a rescue of the partial functional loss of function through the cofactor SOX9 for TESCO. However, prediction of the clinical phenotype because of correlations in functional analysis is not possible