Triton X-114 sulu iki-faz yönteminin mantardan elde edilen polifenoloksidaz'ın eldesi için kullanımı

Mushroom (Agaricus bisporus) polyphenoloxidase (PPO) (EC 1.14.18.1) was isolated and purified using an aqueous two phase system composed of octyl phenol (ethyleneglycol) 7-8 ether (Triton X-114/TX-114). TX-114 is a non-ionic surfactant which thermoseparates in water and forms an aqueous two phase system with a surfactant-depleted top phase and a surfactant-enriched bottom phase. Critical micelle concentration (CMC) and cloud point of the surfactant are 0.17 mM and 22ðC respectively. The partitioning behavior of mushroom PPO in water/TX-114 aqueous two-phase systems was studied and the effects of TX-114 concentration, ionic strength, pH, temperature and crude extract preparation on PPO partitioning were studied. PPO generally partitioned to the surfactant-depleted top phase; whereas many other hydrophobic proteins and molecules partitioned to the surfactantenriched bottom phase. When two-step ultrafiltration was used as a pretreatment, complete enzyme recovery was achieved with all studied TX-114 concentrations. Moreover, about 5 fold purification was achieved by using 8% TX-114. The purification increased to 10 fold by using polyvinylpolypyrolidone (PVPP) at pH 7.0 with a recovery of 72%. However changing pH from 7.0 to 6.0 increased the purification factor and enzyme recovery to 15 fold and 100%, respectively. Addition of potassium or sodium salts caused PPO molecules to partition in the surfactantenriched bottom phase. Finally, crude enzyme can be concentrated besides being purified and recovered by doing aqueous two-phase separation at room temperature.Mantardan (Agaricus bisporus) elde edilen polifenoloksidaz (PPO) (EC 1.14.18.1), oktil fenol (etilenglikol) 7-8 eter (Triton X-114/TX-114) içeren sulu iki faz sistemi kullanılarak ayrıştırılmıştır. TX-114, suda sıcaklığa bağlı deterjanca zengin alt faz ile deterjanca fakir üst faz olarak sulu iki faz sistemi oluşturan anyonik bir deterjandır. Kritik misel derişimi (CMC) ve bulut noktası sırasıyla 0.17 mM ve 22ºC’dir. Mantar vi PPO’ının TX-114 sulu iki faz sistemlerindeki ayrılma davranışı çalışılmıştır ve TX114 konsantrasyonu, ortamın iyonik gerilimi, pH, sıcaklık, ekstrakt hazırlanışı gibi parametrelerin PPO’nun ayrılmasındaki etkileri çalışılmıştır. PPO genellikle deterjanca fakir üst faza ayrılırken, istenmeyen çoğu hidrofobik protein ve fenolikler gibi diğer moleküller deterjanca zengin alt faza ayrılmıştır. Enzim hazırlanışı sırasında iki kademeli ultrafiltrasyon uygulandığı zaman, TX-114 ile çalışılan tüm konsantrasyonlarda, enzimlerin tümünün üst fazda korunumu sağlanmıştır. Ayrıca, 8% TX-114 kullanıldığı zaman yaklaşık 5 kat saflaştırma elde edilmiştir. pH 7.0’ de polivinilpolipirolidon (PVPP) kullanılarak saflaştırma 10 kat artmış ve %72 enzim geri kazanımı elde edilmiştir. Bununla beraber pH 6.0’da çalışıldığı zaman saflaştırma 15.5 kata ve geri kazanım %100’e yükselmiştir. Sodyum veya potasyum tuzlarını eklemek, PPO moleküllerinin deterjanca zengin alt faza ayrılmasına yol açmıştır. Son olarak, sulu iki faz sistemi oda sıcaklığında yapıldığında, enzim saflaştırma ve geri kazanımının yanı sıra konsantre edilmiştir.M.S. - Master of Scienc