Botulinum nörotoksin serotip a inhibitörlerinin ubikitin-proteazom sistem inhibitör kütüphanesinin taranmasıyla belirlenmesi

Botulinum neurotoxins (BoNTs), known as the most potent bacterial toxins, cause potentially lethal disease botulism. BoNTs are classified as category A bioterror agents by many countries because they are easy to produce and have extreme toxicities. On the other hand, BoNTs are considered a therapeutic marvel in medicine because they have been extensively utilized not only for cosmetic purposes to get rid of wrinkles but also to treat various conditions in clinics, including movement disorders. These toxins specifically target cholinergic nerve terminals and block acetylcholine release by cleaving Soluble N-ethylmaleimidesensitive Factor Attachment Protein Receptor (SNARE) complex proteins, which are crucially important for neuroexocytosis. There are eight serologically distinct serotypes of BoNTs (BoNT/A–G, BoNT/X); however, only serotypes A, B, E, and F lead to human botulism. Among these, BoNT/A is the most widely used serotype in clinics and also the most studied serotype as more than half of botulism cases are due to BoNT/A poisoning. BoNT/A has the longest-lasting effect as compared to other serotypes. For example, both BoNT/A and BoNT/E serotypes cleave the same protein, SNAP-25, and the half-life of BoNT/E is limited to days in cells while BoNT/A can be active for up to 6 months in the neuronal cytosol. The underlying mechanisms for the half-life differences between different serotypes have not been well understood. However, there has been heightened research interest in understanding how BoNT/A manages to escape destructive protein degradation machinery in neurons. Recent studies have identified the E3 ligases and deubiquitinases (DUBs) critical for the destruction of BoNT/A. More specifically, one specific E3 ligase, HECTD2, leads to ubiquitination of the enzymatic component of BoNT/A Light Chain (LC) in cells, but the dominant DUB activity of VCIP135 inhibits the proteolytic degradation of the LC. In addition to this, another DUB, USP9X, indirectly affects the stability of BoNT/A in cells. Therefore, the persistence of BoNT/A in the cell can be potentially modified by affecting these factors using small molecule modulators. Modulation of BoNT half-life in cells by small molecules can be important for research purposes to understand intoxication/recovery mechanisms, as well as for the generation of effective countermeasures against botulism. In this study, the main goal was to screen a focused ubiquitin-proteasome system (UPS) inhibitor library to reveal compounds modulating BoNT/A activity and half-life in cells. Our screen utilizing mouse embryonic stem cell-derived motor neurons identified 10 potential lead compounds affecting BoNT/A mediated SNAP-25 in neurons. Then, tested dosedependent effects of the selected compounds and further tested their potential toxic effects in the cell. Following, we explored the effects of the lead compounds on the stability of LC in cells. Small molecules WP1130, b-AP15, NSC632839, PR-619, Celastrol, MDBN, PYR-41, and SL-01 exhibited efficacy against BoNT/A LC action and half-life in cells. Among these, PR-619 appears to be highly crucial as it is an inhibitor of VCIP135 that has been identified as a crucial DUB affecting the half-life of BoNT/A LC. To the best of my knowledge, this is the first study in the literature showing that UPS targeting small molecules can modulate BoNT/A LC action and half-life in cells.Botulinum nörotoksini (BoNT) ölümcül olan botulizm hastalığına sebep olan, bilinen en güçlü bakteriyel toksindir. Yüksek toksisiteye sahip olması ve kolayca üretilebiliyor olması sebebi ile bu toksin birçok ülke tarafından kategori A biyolojik ajanlar sınıfında değerlendirilmektedir. Aynı zamanda, kozmetik amaçlı olarak kırışıklıklardan kurtulmak için kullanılmasının yanı sıra, hareket bozukluklarının da içinde olduğu birçok hastalığın tedavisinde klinik alanda uygun doz ve uygulama ile yaygın olarak kullanılmaktadır. BoNT spesifik olarak kolinerjik sinir terminallerini hedef alır ve nöroeksositoz için kritik öneme sahip olan SNARE kompleks proteinleri keserek asetilkolin salınımını bloke eder. Botulinum nörotoksininin serolojik olarak farklı 8 farklı serotipi vardır (BoNT/A– G, BoNT/X) ancak yalnızca A, B, E ve F serotipleri insanda botulizme neden olur. Bu serotipler arasında, BoNT/A klinik alanda en yaygın kullanılan serotiptir, ayrıca botulizm vakalarının yarısından fazlası BoNT/A zehirlenmesine bağlı olduğu için üzerinde en fazla çalışma yapılan serotiptir. Serotip A, diğer serotiplere kıyasla en uzun ömüre sahiptir. Örnek olarak, Serotip A ve E, aynı proteini (SNAP-25) kesmelerine karşın, BoNT/E hücre içinde bir kaç günlük yarılanma ömrüyle kısıtlıyken BoNT/A sitoplazmada 6 ay kadar aktif bir halde kalabilir. Yarılanma ömürleri arasındaki bu farkların altında yatan moleküler mekanizmalar henüz tam anlamıyla açığa çıkarılmamıştır. Buna karşın BoNT/A'nın nöronlardaki yıkıcı protein bozunma mekanizmasından nasıl kaçtığını anlamaya yönelik araştırma ilgisi artmıştır. Son çalışmalar E3 ligaz ve deubikitasyon enzimlerinin BoNT/A yıkımı için kritik önem arz ettiklerini ortaya çıkartmıştır. Spesifik olarak HECTD2 adındaki E3 ligaz BoNT/A hafif zincirinin ubikitasyonuna sebep olmaktadır ancak bu proteolitik degradasyon VCIP135 isimli deubikitasyon enziminin yoğun aktivitesiyle inhibe edilmektedir. Ayrıca USP9X isimli deubikitasyon enzimi indirekt olarak hücre içindeki BoNT/A stabilitesini etkilemektedir. Bu sebeple, Serotip A’nın hücre içindeki aktivitesinin sürekliliği spesifik düzenleyici faktörler kullanılarak modifiye edilebilir. BoNT/A’nın yıkımını düzenleyen küçük ilaç moleküllerinin geliştirilip tanımlanması, bu serotipe karşın etkili önemler geliştirmesi için önem arz etmektedir. Bu sebeple, bu tez çalışmasında ubikitinproteazom sistemini hedef alan küçük molekül kütüphanelerinin taranması ile BoNT/A intoksitesi üzerinde etkili olan moleküllerin belirlenmesi ve toksinin katalitik olarak aktif kısımı olan hafif zinciri üzerindeki etkilerinin araştırılması hedeflenmektedir. Fare embriyonik kök hücreleri kullanılarak yapılan tarama sonucunda, BoNT/A aracılığı ile SNAP-25 kesilmesine karşı nöronlarda etkinliği olan öncü 10 adet potansiyel bileşik belirlenmiştir. Daha sonra, bu öncü bileşiklerin doza bağlı etkileri ve hücrelerdeki potansiyel toksik etkileri test edilmiştir. Bir sonraki aşamada öncü bileşiklerin hücre içerisindeki LC stabilitesi üzerindeki etkileri incelenmiştir. WP1130, b-AP15, NSC632839, PR-619, Celastrol, MDBN, PYR-41 ve SL-01 adlı küçük moleküller, BoNT/A LC etkilerine ve yarılanma ömrüne karşı etkili sonuç verdiler. Bunlar arasında, PR-619 adlı bileşik, BoNT/A LC'nin yarı ömrünü etkileyen çok önemli bir DUB olarak tanımlanan bir VCIP135 inhibitörü olduğu için oldukça önemli görünmektedir. Bu çalışma, hücrelerdeki küçük moleküllerin mekanik etkisini gösteren literatürdeki bilgimiz dahilinde olan ilk çalışmadır, bu sebeple farklı BoNT serotipleri arasındaki stabilite farklarının sebeplerinin ortaya çıkartılması için önem arz etmektedir.M.S. - Master of Scienc