Integrative study of the proteome throughout tomato fruit development

La tomate (Solanum lycopersicum) [...] présente de nombreux avantages : facilité de culture, temps de génération court, connaissances et ressources importantes, génome séquencé, facilité de transformation... Le développement du fruit est un procédé complexe hautement régulé et divisible en quatre étapes principales : la division cellulaire, l'expansion cellulaire, l’étape appelé « turning » et la maturation. Chaque étape est associée à un phénotype, qui lui-même découle de changements à différents niveaux cellulaires. [...]. Grâce aux récents progrès technologiques et en particulier au développement des «techniques omiques», comme la génomique, la transcriptomique, la protéomique, la métabolomique, les principaux composants cellulaires peuvent désormais être étudiés à haut densité. Dans ce contexte, l'objectif de mon doctorat était d'effectuer une analyse protéomique quantitative du développement du fruit de tomate puis d’intégrer les données «omiques» à la fois par des analyses statistiques et par la modélisation mathématique. Le premier chapitre rapporte les résultats de quantification du protéome de fruit de tomate réalisé en collaboration avec la plateforme PAPPSO (INRA, Gif-sur-Yvette). Des échantillons collectés à neuf stades de développement du fruit de tomate ont été extraits et le protéome quantifié, en absence de marquage, par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS). Ensuite, j'ai cherché la méthode la plus adaptée, testant un ensemble de filtres sur les données, pour obtenir une quantification précise des protéines à partir des intensités ioniques (XIC). Au total, j’ai pu obtenir la quantification absolue de 2494 protéines en utilisant une méthode basée sur la modélisation de l'intensité des peptides. [...] Le deuxième chapitre est consacré aux résultats obtenus par analyses combinées d’«omiques» au cours du développement du fruit de tomate. La transcriptomique a été réalisée en collaboration avec Genotoul GeT (Toulouse) et le groupe Usadel (RWTH Aachen University, Allemagne). Grâce à l’ajout d’étalons internes, plus de 20000 transcrits ont été quantifiés de manière absolue à chacune des neuf étapes de développement. Cette quantification a ensuite été validée par comparaison avec des données de concentration de 71 transcrits précédemment obtenues par PCR quantitative. Enfin, nous avons cherché à intégrer les quatre niveaux de données - transcriptome, protéome, métabolome et activome- afin d‘identifier les principales variables associées au développement. Pour ces quatre niveaux, les analyses ont confirmé que l’entrée en maturation s’accompagne de changements majeurs et révélé une grande similarité entre la fin et le début du développement, notamment au niveau du métabolisme énergétique. Le troisième chapitre porte sur les résultats de modélisation de la traduction protéique obtenus grâce à la quantification absolue du transcriptome et du protéome. Afin d’expliquer la corrélation décroissante observée au cours du développement entre les concentrations en protéines et celles des transcrits correspondants, nous avons résolu un modèle mathématique de la traduction protéique basé sur une équation différentielle ordinaire et impliquant deux constantes de vitesse: pour la synthèse et la dégradation de la protéine. La résolution de cette équation, validée par un critère de qualité basé un intervalle de confiance fermé, a conduit à l'estimation de ces constantes pour plus de 1000 protéines. [...] Enfin le dernier chapitre décrit l’ensemble du matériel et des méthodes utilisées pour obtenir les différents résultats présentés dans le manuscrit. Dans le domaine de la biologie des systèmes, ce travail illustre comment l'intégration de multiples données «omiques» et la modélisation mécanistique basée sur la quantification absolue des «omiques» peut révéler de nouvelles propriétés des composants cellulaires.The interest of the tomato (Solanum lycopersicum) fruit has spread in plant science where it is used as the model for fleshy fruit. The valuable advantages of the tomato fruit are numerous: an ease of culture, a short generation time, a high knowledge with important resources, a sequenced genome, an ease for transforming…. The development of tomato fruit is a complex regulated process, divided in four main steps: cell division, cell expansion, turning and ripening. Each step is characterized by a phenotype resulting from changes at different cellular levels. Thus, gene expression, protein abundance, enzyme activities, metabolic fluxes and metabolite concentrations show significant changes during these steps. Thanks to recent technologies advances and in particular the development of ‘omics techniques’, such as genomic, transcriptomic, proteomic, metabolomic, the main cell components can now be analysed by high-throughput. In this context, the objective of my PhD was to perform a quantitative proteomic analysis of the tomato fruit development and then integrate omics data both by statistical analyses and by mathematical modelling. The first chapter focused on results obtained for the quantitative proteomic developed in collaboration with the PAPPSO platform (INRA, Gif-sur-Yvette). Samples were harvested at nine stages of tomato fruit development, total proteome was extracted and quantified by label-free LC-MS/MS. Then I searched for the most appropriate method, testing a set of filters on the data, to obtain an absolute label-free protein quantification from ion intensities (XIC). Finally, I obtained the absolute quantification of 2494 proteins using a method based on peptides intensity modelling. The quantification of proteins by LC-MS/MS was then validated by comparison with 32 enzymatic capacities used as proxy for protein abundance. The second chapter was dedicated to the results of integrative omics analyses throughout tomato fruit development. First, transcriptomic has been performed in collaboration with Genotoul GeT (Toulouse) and Usadel‘lab (RWTH Aachen University, Germany). Using spikes in the experimental design, more than 20000 transcripts have been quantitatively determined at the nine stages of development. Then, this absolute quantification of the tomato transcriptome has been cross-validated with 71 transcripts previously measured by qRT-PCR. Finally, we integrated the four omics datasets- transcriptome, proteome, metabolome and activome – in order to identify key variables of the tomato fruit development. For the four levels, analyses confirmed that the entrance in maturation phase was accompanied by major changes, and revealed a great similarity between the end and the beginning of development, especially in the energy metabolism. The third chapter focuses on modelling results of the protein translation based on the absolute quantification of transcriptomic and proteomic. To explain the decreasing correlation observed between proteins and transcripts concentration throughout development, we proposed a mathematical model of protein translation based on an ordinary differential equation and involving two rate constants (for synthesis and degradation of the protein). The resolution of this equation, validated by a quality criteria based on a closed confidence interval, led to the estimation of the rate constants for more than 1000 proteins. These results were then compared with previous published data reported for plants and more widely in eukaryotic cells. Finally, the last chapter describes all the materials and methods used to obtain the results presented in the manuscript.In the systems biology context, this work illustrates how integration of multiple omics datasets and mechanistic modelling based on absolute omics quantification can reveal new properties of cellular component