Characterization of crispr/CAS9 edited kcnq1 gene variants in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes

Kalp ritim bozukluklarından klinikte sıklıkla rastlanan kalıtımsal Uzun QT (UQT) sendromu, hastaya özgü uyarılmış pluripotent kök (UPK) hücre kökenli kardiyomiyositler kullanılarak in vitro modellenebilmektedir. UQT sendromu Tip 1 tanısı konulmuş hastalardan ürettiğimiz UPK hücrelerinde var olan heterozigot KCNQ1 c.965 C/T gen mutasyonu CRISPR sistemi ile vahşi tip alele laboratuvarımızda çevrilmiştir. Tez kapsamında, CRISPR/Cas9 genom düzenleme sonrası homolog olmayan uçların birleşmesini esas alan DNA tamir mekanizması ile düzenlenen 3 farklı KCNQ1 delesyon varyantı TA klonlama yöntemi ile ayrıştırıldı. Yeni gelişen mutasyonların ikisi KCNQ1 protein sekansında çerçeve kaymasına sebep olurken, bir varyantta erken durdurucu kodon oluşturduğu ön görüldü. CRISPR ile düzenlenen ve köken aldıkları sağlıklı ile mutant UPK hücrelerinden elde edilen kardiyomiyositler, moleküler ve elektrofizyolojik olarak incelendi. KCNQ1 varyantlarına sahip olan kardiyomiyositlerin farklılaşma süreçlerinde, ürettikleri gen ve protein miktarlarında sağlıklı hücrelere göre istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık gözlenmedi. Yapılan Ca+2'a bağlı Fluo-4 görüntüleme analizlerinde, hastalarda gözlenen QT aralığındaki uzamaya benzer olarak mutant KCNQ1 geni ifade edilen kardiyomiyositlerin kasılma-gevşeme mesafesinin sağlıklı kardiyomiyositlere göre uzadığı gözlendi. KCNQ1 kanal modülatörü ML277 ve JNJ303, sağlıklı, mutant ve genetik olarak düzenlenmiş hücrelerde uygulanarak elektrofizyolojik etkileri incelendi. Gelecek çalışmalarda oluşturulan bu in vitro modelde ve farklı iyon kanalı mutasyonuna sahip kardiyomiyositlerde farklı ilaçlar ve dozları incelenebilir. Böylece ilaç moleküllerinin klinikte UQT sendromunun tedavisine yönelik yeni uygulamalar geliştirilebilir ve hastalık mekanizması detaylı incelenebilir.Hereditary Long QT (LQT) syndrome is frequently encountered in the clinic and it causes cardiac rhythm disorders. LQT syndrome can be modelled in vitro using patient specific induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived cardiomyocytes. Genome editing studies were performed by targeting the heterozygous c.965 C/T mutation in KCNQ1 gene of iPSCs obtained from patients diagnosed with Long QT (LQT) syndrome type 1. After genetic modification by CRISPR/Cas9 system, random deletions were detected in 3 different variants of iPSCs which edited DNA repair mechanism by NHEJ. Heterozygous sequences generated after genome editing were separated by TA subcloning. Newly developed mutations were shown to cause frame shifts in the KCNQ1 protein sequences while producing an early stop codon in one variant. Cardiomyocytes obtained from CRISPR-edited cells and from healthy and mutant iPSCs were examined at the molecular and electrophysiological level. In the differentiation processes of cardiomyocytes with KCNQ1 variants, there was no statistically significant difference in expression of cardiac specific genes and proteins when compared to healthy cells. However, in electrophysiological analyses, the QT interval of cardiomyocytes with mutant KCNQ1 gene were found to be longer than healthy cells similar to the clinical phenotype. Several drug candidates allosterically interacting with KCNQ1 protein, such as ML277 and JNJ303, have been studied for therapeutic potential in genome-edited iPSCs derived cardiomyocytes. In the future studies, therapeutic application can be screened in the in vitro platform developed in this study that has various forms KCNQ1 mutations. This way, disease mechanism can be explored in greater detail and new drug candidates can be developed